微生物生物技術 葡萄王生技股份有限公司 陳勁初 2009.03.25

應用微生物  發酵學

I.菌種管理 a.來源: I. 食研所生資中心(BCRC) II. 中國科學研究院 III.上海農業科學研究院 IV. 自行篩選分離

b.保存: I.冷凍保存 : -20℃ -80℃ -196℃ II.繼代培養 : 小米(麥)粒 斜面 礦物油

c.確認: I. 柯霍法測 II. DNA (18S rDNA) III.委託鑑定

V. Chemical finger print VI. Contamination : Yeast . Bacteria . Mold I. Enzyme : API Zym II. Culture : API CH50 III. DNA : RFLP IV. Flavor & Pigment V. Chemical finger print VI. Contamination : Yeast . Bacteria . Mold

API Zym

API CH50

DNA : RFLP M As As2 Ac 396 401 wAc As As2 Ac 396 401 wAc M

Flavor & Pigment

Chemical finger print Ac -凍-MeOH萃

II.種菌製備 I. Fresh , nutritious , adaptive II. PDA , MA , YM , TSA / pH III. Refresh by pour plates IV. Pick single colony

I. Goose-neck bottle test II. Sterilization time from hot or b. 2L Hinton flask : I. Goose-neck bottle test II. Sterilization time from hot or cool point III. Cooling in autoclave IV. Loop , not tip V. Cap and inoculum practice VI. Shear stress

三角瓶培養管理 澄清試驗: Exclude bacteria & yeast Plate test: exclude mold Active mycelium vs. inactive mycelium check with microscope

Table .Actual cycle time (121C,saturated steam) Required to sterilize materials an autoclave Material Time(min) Erlenmeyer flasks 2000 ml ……………………………… 30-35 1000 ml ……………………………… 20-25 500 ml ……………………………… 17-22 200 ml ……………………………… 12-15 125 ml ……………………………… 12-14 “Square-Pak”Pyrex Flase,1000 ml ……30-35 Serum bottle, 9000 ml …………………50-55 Milk dilution bottle, 100 ml ……………3-17 Test tubes 18 by 150 mm …………………………12-14 32 by 200 mm …………………………13-17 38 by 200 mm …………………………15-20

c. 100L ~500L ferementor ： I. Agitation or air-lift II. Mycelium pellet III. Clearance IV. In laminar flow V. Microscope check after pouring out before inoculum

發酵培養 a. Steps越少越好 b. Seed 愈年輕越好 c. Antifoam 事先探討 d. Shear stress 判斷與降低 e. Adaptive culture : e g. SO2 / wine, beer / 9℃ ,主發酵之趨近

發酵培養 衰亡期之判斷: Ⅰ. 菌體活性低,胞內顆粒多,出現液泡, 菌體膨大或不規則(methylene blue) Ⅱ. 自溶現象, 產孢現象. Ⅲ. 二次代謝物之產生. Ⅳ. 二次生長現象 : 2 種 C or N. sources.

百升級管理 CIP 接菌槽設計 Log phase~ early stationary phase

III.主發酵 I. Cheap , convenient , easy-treated a. Medium : I. Cheap , convenient , easy-treated II. Chemicals excluded out III. Cl , antibiotic survival b. Log phase seed:

噸級管理 (2-5T) CIP Sparging hole Plate assay Microscope Foaming Bioassay and chemical assay

c. Separation ? Concentration ? Dryness ? Milling? d. Contamination ? IV.收槽 a. When ? 1° or 2° metabolites b. How ? Boiling ? c. Separation ? Concentration ? Dryness ? Milling? d. Contamination ? e. Capacity of down-stream

Downstream Boiling Conc. : over night F. Dry: over night / bag-packing Milling into powder

V.QC a. Functional ingredients b. Safety c. E.coli , coliform ?

VI. 敗槽 a.菌相確認. b.耐熱性測試. c.耐熱菌之處理：如前所述. 非耐熱菌之處理：無菌測試. O.K ：接種種菌，tank，pipe，laminar flow Not O.K ：槽內焊縫，filter air，壓力測試. 蛇管/排管，無縫管.

成品管理 Particle size Moisture & hygroscopic 流動性 微生物檢測

VI.規劃 a. Down steam設備 比fermentor 貴很多，且越大越貴. b.依製程規劃，使閒置越少越佳. c.勿一次投入太大，營業部門常過分樂觀. d.料方便，人方便，GMP規劃. e.多槽對多槽方式，彈性大.

VII.應用 產業界各種微生物發酵代工 樟芝、靈芝、雲芝、 桑黃、白樺耳 、巴西蘑菇、蟲草、蛹蟲草、舞茸、猴頭菇

菌種的篩選 1.菌的特性:Bacteria. Yeast . Mold. (Yeast-like mold) a. pH: growth & germination limit b. temp: c. Aw: d. thermotolerance : spore & germination e. Juice & milk. f. soft drink & water g. Nutrient requirement: biotin for S. cerevisiae for C. glutamioum

菌種的篩選 2. Screen: a. Lab mixture : yogurt b. Yeast / mold mixture : anka. Beka c. Bacteria / mold : cheese d. Lab / Yeast : Kefir e. 藻類/bacteria : 綠藻池 f: eppendorf slant for wild mushroom collection.

菌種的篩選 g: functional screen : amylase. Protease. chitinase. phytase. lysine. Antibiotics. Streptovidin (avidin). rec assay. Analog assay. Surfactant / 羊血 3.採樣 : a. soil sample : Bacteria(108), streptomyces(107), mold(106), Yeast(105),algae(104),protoza(103)/g (1)耕土 , 草地: B. s, 山坡土落葉多: M. r., 沙土(乾):s (2)植被 : 蕃茄地/ vit. c 生產菌 葡萄地/ Yeast 豆科/根瘤菌 銀杏林/ Actimomyces

菌種的篩選 (3)太空包,森林 : 纖維素分解菌/ Brown rot white rot 浸竹池 / Bacillus ; 嗜酸菌 : 冶金, 生物脫硫 b. 豆類,肉類加工廠: protease. Lipase ( Tween / Nile blue) 麵粉廠: amylase 花蜜. 蜂蜜. 蜜餞 : Yeast. (baker yeast) 柑橘. 草莓. 山芋: (Congo Red/ pectin)

菌種的篩選 c. 局部極端環境: 回收機油(黑油): Yeast (Rhodotorula) 排油煙管. 溫泉: 耐熱菌 80 ~ 110℃, 不怕污染 高山凍土. 深海: 低溫菌(軸封)15℃. 培養for detergent. 深海:耐壓菌 (600 atm) Micrococcus 海參. 海鞘 : Bacteria toxin or antibiotic 深海魚腸 : 嗜壓古細菌: EPA, DHA 生產菌

菌種的篩選 4. enrich : a. sole C or N source (N2, 苯氨: cellulose, lignin. CO2, 有機酸,脂,烃 ) b. bait & trap : KCl, strach c. wet 80℃, 10 min for spore producer, dry air heating

d. 10% phenol : inhibit mold & bacteria / for streptomyces. bile salt : inhibit G(-) Bacteria. Penicillin. streptomycin, neomycin: Bacteria / Yeast. Mold. 放線菌酮: M.Y. Streptomyces 硫乙醇酸鈉: 嫌氣菌 e: serial dilution tubes : acid, antibiotics, bactericin, 大蒜汁, essential oil. 5.Agar  flask  filtrant/ Agar  tube assay : medium C/N, c:source, N source. 6.Unculturable : Megagenome cloning

菌種退化與複壯 自發性突變的結果 : 發生在細胞群體中，一個由量變到 質變的逐步演化過程. A. 表現型: a. 細胞 or 菌落型態改變 e g. 畸形菌落,光禿不產孢 b. 生長速度變慢 c. 產量降低 d. 抗逆能力下降: 病源菌, 噬菌體,溫度等 B. Subculture越多代愈易退化,環境不佳愈易退化

菌種退化與複壯 C. 複壯: a. 純菌落分離培養 b. 透過寄主體複壯 c. 利用環境篩除已衰退個體 d. 良好的保存方法: e g. 蒸餾水保存方法

發酵培養 發酵培養: a. steps越少越好 b. seed 愈年輕越好 c. antifoam 事先探討 d. shear stress 判斷與降低 e. adaptive culture : e g. SO2 / wine, beer / 9℃ ,主發酵之趨近

發酵培養 衰亡期之判斷: Ⅰ. 菌體活性低,胞內顆粒多,出現液泡,菌體膨大或不規 則(methylene blue) Ⅱ. 自溶現象, 產孢現象. Ⅲ. 二次代謝物之產生. Ⅳ. 二次生長現象 : 2種 C or N. sources.

A.菌種管理 保存與定期更新 長期保存方法開發及測試 菌種複核特性 科霍法則

B.接菌管理 專用 laminar flow & UV殺菌 接菌技巧: 巴斯德鵝頸瓶試驗 E. coli : 70 %Ethanol : wash, not killing as soap

C.三角瓶培養管理 澄清試驗: exclude bacteria & yeast plate test: exclude mold active mycelium vs. inactive mycelium

D.百升級管理 CIP 接菌槽設計 log phase~ early stationary phase

E.噸級管理 (2-5T) CIP sparging hole plate assay microscope foaming bioassay and chemical assay

F. Downstream Boiling conc. : over night F. Dry: over night / bag-packing milling into powder

G.成品管理 Particle size moisture & hygroscopic 流動性 微生物檢測

謝 謝 指 教