PCR檢測植物病毒感染 PCR PVX, TMV, ToLCTWV 植物生理學實驗12 PCR檢測植物病毒感染 PCR PVX, TMV, ToLCTWV 指導教授：傅士峯老師 助教：呂學宇、張凱雅 值日組：G12、G13 2016.05.25

實驗目的 觀察植物在特定病毒感染後病徵 利用PCR技術檢測植物是否有被病毒感染 2016.05.25

實驗原理- 病毒 病毒 PVX TMV ToLCTWV ① 基因體  primer ② 病徵

實驗原理- PVX 基因體： Viruses 病毒 Order ssRNA 單鏈RNA病毒 Family  Flexiviridae  彎曲病毒科 Genus   Potexvirus  嵌紋病毒屬 Potato virus X  馬鈴薯 X 病毒 /馬鈴薯微嵌紋病毒 基因體： 。病毒顆粒為絲狀彎曲 ( Transmission electron micrographs) 。PVX 感染茄科植物其病徵表現主要為系統性，感染藜科（Chenopodiaceae）或莧科（Amaranthaceae）後會造成局部性病斑（local lesions），也會感染部分豆科植物（Leguminosae）。

實驗原理- PVX 病徵： ① 潛伏感染，並無明顯 ② 輕微：斑駁 ③ 嚴重： a. 皺葉嵌紋 b. 植株矮化 c. 新生葉片小化  Viruses  病毒 Order ssRNA  單鏈RNA病毒 Family  Flexiviridae  彎曲病毒科 Genus   Potexvirus  嵌紋病毒屬 Potato virus X  馬鈴薯 X 病毒 /馬鈴薯微嵌紋病毒 病徵： ① 潛伏感染，並無明顯 ② 輕微：斑駁 ③ 嚴重： a. 皺葉嵌紋 b. 植株矮化 c. 新生葉片小化 d. 植株頂端、塊莖大量壞疽 植株死亡 。病毒顆粒為絲狀彎曲 。PVX 感染茄科植物其病徵表現主要為系統性，感染藜科（Chenopodiaceae）或莧科（Amaranthaceae）後會造成局部性病斑（local lesions），也會感染部分豆科植物（Leguminosae）。

實驗原理- TMV 基因體： Viruses 病毒 Order ssRNA 單鏈RNA病毒 Family Genus  Tobamovirus  菸草鑲嵌病毒屬 Tobacco mosaic virus 煙草嵌紋病毒 基因體： 人類第一個成功分離出的病毒 以通過濾過器，故又稱「濾過性病毒」，引起的病害稱「病毒病」、「毒素 病」，為介於生物與非生物之間的病原體

實驗原理- TMV 病徵： ① 葉部呈現不規則之暗綠色與淡綠嵌紋，嵌紋邊緣多為波浪狀 ② 葉片細胞壞疽 ③ 葉片向下捲曲  Viruses  病毒 Order ssRNA  單鏈RNA病毒 Family  Genus  Tobamovirus  菸草鑲嵌病毒屬 Tobacco mosaic virus 煙草嵌紋病毒 病徵： ① 葉部呈現不規則之暗綠色與淡綠嵌紋，嵌紋邊緣多為波浪狀 ② 葉片細胞壞疽 ③ 葉片向下捲曲 在菸草(Nt)過敏反應  NN vs nn 人類第一個成功分離出的病毒 以通過濾過器，故又稱「濾過性病毒」，引起的病害稱「病毒病」、「毒素 病」，為介於生物與非生物之間的病原體  mosaic, mottling (Figures 1 and 2), necrosis (Figures 3 and 4), stunting, leaf curling, and yellowing of plant tissues.

實驗原理- ToLCTWV Viruses 病毒 Order ssDNA 單鏈DNA病毒 Family Geminiviridae  雙生病毒科 Genus Begomovirus  豆類金黃嵌紋病毒屬 Tomato leaf curl Taiwan virus 台灣番茄捲葉病毒 C1 Replication initiator protein (Rep) C2 Transcription activator protein (TrAP) C3 Replication enhancer protein (REn) C4 Symptom determinant V1 Coat protein V2 Precoat prorein

實驗原理- ToLCTWV 病徵： ① 植株嚴重矮化 ② 葉片明顯朝上捲起、變形 ③ 從葉緣及中肋附近區域明顯黃化現象 ④ 花枯萎現象  Viruses  病毒 Order ssDNA  單鏈DNA病毒 Family Geminiviridae  雙生病毒科 Genus Begomovirus  豆類金黃嵌紋病毒屬 Tomato leaf curl Taiwan virus 台灣番茄捲葉病毒 病徵： ① 植株嚴重矮化 ② 葉片明顯朝上捲起、變形 ③ 從葉緣及中肋附近區域明顯黃化現象 ④ 花枯萎現象 ⑤ 罹病植株結果很少；開花期以前罹染此病毒幾乎無法結果

預期結果 – PVX, TMV PVX TMV

預期結果 - ToLCTWV

實驗步驟 控制組 (G12, G13) - 實驗組 ToLCTWV

實驗步驟 萃 取 DNA PCR 電 泳

實驗步驟 - 萃取DNA 利用打洞器裁出 3-5 mm直徑的葉片 將 1 片葉片放入1.5 ml離心管中，加入100 μl 溶劑 註：在蓋子寫上 組別和 DNA 利用打洞器裁出 3-5 mm直徑的葉片 將 1 片葉片放入1.5 ml離心管中，加入100 μl 溶劑 65 ℃加熱5分鐘  98 ℃加熱2分鐘 置於冰上2分鐘 所得液體即為萃取液 進行濃度測定 註：不要研磨葉片

實驗步驟 + 加19 ml混合液於PCR tube後，再加1 ml DNA 1 ml DNA master mix Primer F’ 註：在蓋子寫上 組別和 DNA 加19 ml混合液於PCR tube後，再加1 ml DNA DNA： Con / ToLCTWV (C2) ml master mix (Taq, buffer, dNTP, dye) 10 Primer F’ 4 Primer R’ ddH2O 1 Total 19 PCR condition 94℃ 2 min 30 S 50℃ 1 min 72℃ 10 min 16℃ ∞ 35 cycles 114 bp + 1 ml DNA 20 ml (19 ml mix + 1 ml DNA)

實驗步驟 Con 病毒 控制組 (G12, G13) - 實驗組 ToLCTWV

實驗步驟 萃 取 DNA 與 濃 度 和 純 的 測 定 、 稀 釋 PCR 電 泳

實驗步驟 Marker加入2 ml 控制組與實驗組分別加入5 ml 設定電壓與時間，95V 跑 35分鐘 外染 利用UV光照膠

實驗結果 標示自己組別與DNA名稱 (Con / 病毒) 判斷目標DNA的分子量大約有多少 藉由膠圖可以得到什麼結果？請說明

問題與討論 為什麼電泳圖上的分子量大小，由上到下是由大到小？ 大 小

報告繳交 報告格式： 實驗目的、原理、結果、問題討論、 補充資料（自行整理）、心得 繳交期限：下週 (6/15) 課程結束前