临床微生物检测技术中的革兰氏染色与细菌接种 -千里之行，始于足下

细菌细胞壁结构 革兰氏阴性 革兰氏阳性

染色结果 G＋菌 G－菌 仔细观察（染色性，形态，排列），绘图

革兰氏染色法由丹麦医生Hans Christian Gram (1853-1938) 于1884年创立，是细菌学中重要的鉴别染色法。 通过此法染色，可将细菌鉴别为革兰阳性菌（G+）和革兰阴性菌（G-）两大类。 革兰氏染色的意义 鉴别细菌，初筛标本 帮助选择用药 帮助确定致病物质 Gram, HC (1884). "Über die isolierte Färbung der Schizomyceten in Schnitt- und Trockenpräparaten" (in German). Fortschritte der Medizin 2: 185–189 .

G＋菌胞壁结构致密，肽聚糖层厚，脂质含量少，乙醇不易透入。同时乙醇使细胞壁脱水形成一道屏障，阻止结晶紫—碘复合物从胞内渗出，故细菌仍保留初染时的紫色。

法国生物梅里埃全自动革兰氏染色系统 PREVI™ Color Gram 操作简便，只需手工加载涂片 5分钟内即可得到标准化结果 显著提高结果重复性、可靠性 操作完成后涂片已干燥，可直接镜检 减少接触感染性标本，提高生物安全性 高通量设计，每小时可处理180/450张涂片

关键技术 革兰氏染色 PREVI™ Color Gram 机械转盘 喷雾染色 涂片卡玻片转盘的卡位上，随转盘高速旋转。 玻片位置固定，没相互接触，不会交叉污染。 喷雾染色 5个喷嘴在设定的时间内定量定时喷出不同的溶液以完成染色过程。 染色步骤可设定，节省试剂。 标准的八步骤染色流程，结果标准可靠。  

实验内容 一，革兰氏染色（操作） 二，细菌接种 平板划线法（操作） 斜面培养基接种法（操作） 半固体培养基接种法/穿刺接种法（操作） 液体培养基接种法（操作） 细菌在液体、固体、半固体培养基中的生长现象（示教）

实验步骤（无菌操作） 拔或塞试管帽时，应将试管口通过火焰略加烧灼； 接种环使用前后应在火焰上烧灼灭菌

实验步骤（制备玻片标本） 涂片：先取一接种环生理盐水放于载玻片的一端，左手持菌液试管，右手持接种环，用接种环从试管培养液中挑取少许大肠杆菌或金黄色葡萄球菌培养物与盐水混匀，涂成直径约1厘米的涂片，涂片应薄而均匀。 干燥：涂片最好放置室温中，待其自然干燥。 固定：手执玻片的一端，标本面向上，在火焰外层较快地来回通过三次，约2~3秒，以玻片反面触及皮肤，以不觉过分地烫为度。（待放置冷却后，进行染色。）

固定的目的 ① 杀死微生物，固定其细胞结构 ② 保证菌体能牢固地粘附在载玻片上，以免水洗时被水冲掉 ① 杀死微生物，固定其细胞结构 ② 保证菌体能牢固地粘附在载玻片上，以免水洗时被水冲掉 ③ 改变菌体对染料的通透性，一般死细胞原生质容易着色。

实验步骤（革兰氏染色） 初染：滴加结晶紫染液,染1分钟,水洗。 媒染：滴加卢戈氏碘液,作用1分钟后,水洗。 脱色：加95%酒精2~3滴于涂片上,频频摇晃3~5秒钟后,斜持玻片,使酒精流去;再滴加酒精,如此反复2~3次,直至流下的酒精无色或稍呈淡紫色时为止,约半分钟。水洗。 复染：滴加稀释石炭酸复红染1/2~1分钟,水洗,待干, 油镜检查。

实验步骤（油镜的使用） 准备：将所用低倍物镜拉下，上抬载物台使玻片靠近物镜最近 聚焦：先用粗调螺旋，往下调节载物台，使玻片缓慢远离物镜，找到物象，再用细调螺旋，聚焦 先用低倍镜，并将所要观察部分移至视野的中央。 移开低倍镜，换用高倍镜（20X；40X）进一步聚焦，并把所要观察部分移至视野中央。 移开高倍镜，并将油镜转玻片一侧备用。 在盖玻片上滴一滴香柏油，然后将油镜转正对准通光孔，油镜镜头浸入香柏油 (注意操作动作要慢，以免压碎玻片或损坏镜头)。 从目镜内观察，用细调螺旋微微上下聚焦，至视野内出现清晰的物像时为止。

实验步骤 （油镜的清洁和显微镜的保护） 油镜使用完毕后，必须用拭镜纸沾少许二甲苯将油镜上的香柏油擦净，并用干的拭镜纸檫去二甲苯。 显微镜用毕后，升高镜筒，取下玻片标本，转动旋转盘，使每个物镜都不对准通光孔，再下降镜筒，使物镜接近载物台，将聚光镜降下，最后放回橱内。

平板分区划线

平板分区划线

意大利Diesse公司产品 The Robobact System is a modern, completely automatic processor which allows bacteriological isolation without the need to open the sample container , guaranteeing maximum safety for the operator and complete standardization of seeding.

Robobact System 关键技术 专用样本采集管 条形码识别 轨道和机械臂 划线分离技术 测定培养基导电性和电压 计算机控制 测定气压 光电技术 (CO2感受器，指示剂变色或释放荧光-电信号)

培养基 适合于细菌生长繁殖需要的各种营养物质在PH(7.2~7.6)条件下配制而成的基质。 培养基配成后—〉灭菌

培养基分类 （按物理性状分） 液体培养基 半固体培养基 （含0.1～0.5%琼脂） 观察穿刺线、保存菌种 固体培养基 （含2～3%琼脂） 平板：划线分离，菌落计数，分离纯化 斜面：纯种移种

培养基分类 （按营养成分分类） 基础培养基 营养培养基 含细菌菌生长的基本营养成份 加入糖，血，血清，酵母浸膏等 ，用于营养要求高的细菌的培养，如：血平板

培养基分类 （按用途分） 合成培养基 鉴别培养基 选择培养基 厌氧培养基 用于研究细菌代谢过程、特殊菌的分离培养 含有特定的作用底物，如糖发酵管，葡萄糖蛋白胨水 选择培养基 在培养基中加入抑制某些细菌生长的物质，而选择性地允许另外一些细菌的生长。如肠道致病菌选择培养基：SS培养基，抗生素培养基  厌氧培养基 庖肉培养基

实验内容 一，革兰氏染色（操作） 二，细菌接种 平板划线法（操作） 斜面培养基接种法（操作） 半固体培养基接种法/穿刺接种法（操作） 液体培养基接种法（操作）

一，平板划线法（操作）

实验步骤（平板划线法） 不要说话，严格无菌操作 灼烧接种环后要冷却 取一环葡萄球菌或大肠杆菌 划线时用腕力，不要使接种环嵌入琼脂 各个分区要分明 在培养皿底部贴标签 倒置培养以防止结晶水冲散细菌

二，斜面培养基接种法（操作）

斜面接种时的无菌操作 (1)接种灭菌 (2)开启棉塞 (3)管口灭菌 (4)挑起菌苔 (5)接种 (6)塞好棉塞

实验步骤（斜面接种法） 用左手握住菌种管（葡萄球菌或大肠杆菌）和斜面培养基管，右手持接种环。 用右手小指与手掌、小指与无名指分别拔出两管的棉塞，将管口通过火焰灭菌。 用接种环或接种针伸入菌种管内，挑取用来接种的菌苔。 伸入斜面培养管内，先从斜面底部到顶端拖一条接种线，再自下而上蜿蜒划线。 接种完成之后，用火焰灭菌培养管口，并塞上棉塞，置于37℃培养。

三，半固体培养基接种法/ 穿刺接种法（操作） 三，半固体培养基接种法/ 穿刺接种法（操作）

穿刺接种法

实验步骤（穿刺接种法） 用左手握住菌种管（大肠杆菌或痢疾杆菌）和半固体培养管，右手持接种针。 用右手小指与手掌、小指与无名指分别拔出两管的棉塞，将管口通过火焰灭菌几次。 用接种针伸入菌种管内，挑取用来接种的菌苔。 垂直刺入半固体中心，至近管底部，然后沿穿刺线退出。 塞回棉塞，接种针重新灭菌。接种完毕，于37℃培养18—24h，观察生长情况。

四，液体培养基接种法（操作）

实验步骤（液体培养基接种法） 用灭菌接种环挑取用来接种的菌苔。 在试管内壁与液面交界处轻轻研磨，使细菌均匀得散落在液体培养基中。 菌种管：葡萄球菌/大肠埃希菌/痢疾杆菌 在试管内壁与液面交界处轻轻研磨，使细菌均匀得散落在液体培养基中。