PCR法检测细菌核酸 河北大学 基础医学实验教学中心
（一）PCR技术的基本原理 类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
PCR optimization 变性温度和时间 退火温度与时间 延伸温度和时间 循环次数 92-95℃，富含G和C的序列，可适当提高，但过高或时间过长都会导致酶活性损失。 退火温度与时间 引物中G、C含量高、长度长并与模板完全配对时，应提高温度。温度越高，产物特异性越高。通常37-55℃、1-2分钟。 延伸温度和时间 温度：72℃，接近Taq酶的最适75℃ 时间：过长会导致产物非特异性增加。但对低浓度的目的序列，则可适当增加时间。 循环次数 循环过多，非特异性产物大量增加
（三）PCR反应体系 ddH20 13.5 μl 10×Buffer 2 μl 引物F27 1 μl（50 pmol/l） 引物R1492 1 μl（50 pmol/l） dNTPs 2 μl（2.0 mmol/l） Taq酶0.5 μl（2.5 U） 用无菌牙签挑取菌体若干
（四） PCR反应：（35 个循环） 94℃ 预变性DNA 30s 94℃ 变性 30s 52℃ 退火 30s 72℃ 延伸 120s 35 个循环后 72℃ 补充延伸 10 min 4℃保存