细胞器的分级分离 [目的要求] 1．掌握差速离心法和密度梯度离心法的原理。 2．熟悉哺乳动物细胞的细胞核、线粒体分离和纯化的实验方法。
[实验原理] 球形颗粒的沉降速率取决于其密度、半径、介质黏度和离心力。 差速离心法（differential centrifugation）是将细胞匀浆在密度均一的介质中从低速到高速离心，较大颗粒先在低速离心时沉淀，再用高速离心沉淀上清液中的小颗粒物质，从而达到逐级分离细胞器的目的。 密度梯度离心法（density gradient centrifugation）是一定介质形成一连续或不连续的密度梯度，顶部的细胞匀浆在重力或离心力场的作用下分层、分离。一般先通过差速离心法将细胞器初步分离，再进一步通过密度梯度离心法分离纯化细胞器。
细胞器的分离常通过组织细胞匀浆、分级分离和分析三个步骤完成。 分级分离方法有两种，即：差速离心法和密度梯度离心法。
[实验用品] 1．器具：玻璃匀浆器、低速离心机、高速冷冻离心机、天平、普通光学显微镜、1.5 ml Ep管、载玻片、10 ml滴管、冰盒、冰块、滤网、染缸、20 ml烧杯。 2．材料：大白鼠。 3． 试剂：生理盐水、PBS、0.25 mol/L的蔗糖溶液、0.34 mol/L蔗糖-0.5 mmol/L Mg(Ac)2溶液、0.88 mol/L蔗糖-0.5 mmol/L Mg(Ac)2溶液、95％乙醇、甲基绿-派洛宁染液、丙酮、0.2％的詹纳斯绿B。
[实验步骤] 1．组织匀浆制备 （1）取材 将空腹12～24 h的大鼠处死。剖开腹部， 迅速取出肝脏，用预冷的生理盐水洗净血污，用 滤纸吸干。 （2）制备匀浆 称取约1～2 g左右的肝组织，用预冷 的0.25 mol/L的蔗糖溶液冲洗数次，剪碎。以预 冷的0.25 mol/L的蔗糖溶液悬浮剪碎的组织，移 入匀浆器内，在冰浴条件下匀浆。匀浆完成后， 用滤网过滤，即制得肝细胞匀浆，备用。
2.细胞器的分级分离 (1)细胞核的分离： 第一次:1000rpm,8min。 (2)细胞核的纯化 在沉淀中加入0.34mo1/L蔗糖-0.5mmol/L Mg(Ac)2至2ml，混悬。用长针头注射器在混悬液下轻轻加入2ml 的0.88mo1/L蔗糖-0.5mmol/L Mg(Ac)2溶液。尽量使两种溶液明显分层。 2000rpm离心8min。 上清保留于试管1.0处 加0.25M蔗糖至4ml，混匀 重复1次 第二次:1300rpm,8min。弃上清
(3)细胞核鉴定： 涂片：在离心后的沉淀中加入几滴PBS，混匀后涂片，空气干燥 固定：浸入95％的乙醇溶液5min，晾干 。 涂片：在离心后的沉淀中加入几滴PBS，混匀后涂片，空气干燥 固定：浸入95％的乙醇溶液5min，晾干 染色：滴加甲基绿-派洛宁染液染色15min 分色:快速放入丙酮中，蒸馏水漂洗，擦干水分 显微镜下观察结果
(4)线粒体的分离 将分离细胞核时收集的上清以10000 g 离心10 min，将上清移入1 (4)线粒体的分离 将分离细胞核时收集的上清以10000 g 离心10 min，将上清移入1.5 ml Ep管内并置冰上或4℃冰箱待用。沉淀用0.25 mol/L的蔗糖溶液重悬后， 10000 g离心10 min，重复1次，取沉淀。 (2)线粒体的鉴定 于洁净载玻片上滴1滴0.02％～1％的詹纳斯绿B染液，用牙签挑取线粒体沉淀均匀涂于染液中，染色5～10 min，盖上盖玻片，镜检。
[结果与分析] 光学显微镜下观察，细胞核经甲基绿-派洛宁染色，DNA呈蓝绿色，核仁和胞质RNA呈红色。观察分析完整细胞核的数量及其比例。线粒体经詹纳斯绿B染色呈亮绿色。溶酶体可用酸性磷酸酶显示法鉴定。光镜下看不到溶酶体的形态特征，但可看到代表溶酶体的棕黑色颗粒或团块。如果分离到的细胞组分符合其形态学及酶学特征，而且没有其他组分的污染，则证明分离操作成功，反之则为失败。
[注意事项] 1．组织匀浆时，既要尽可能使细胞完全破碎，又 要尽量快速。 2．在细胞器分离过程中，所有操作应尽可能在 1～4℃下进行。 3．实验过程应注意保持细胞器的完整性，避免操 作过于剧烈。另线粒体进行的是活体染色， 要求样品制备好后尽快染色。
[作业与思考题] 1．分别在高倍镜和油镜下观察细胞核和线粒体， 并绘制其结构图。 2．简述细胞器分级分离的实验原理和主要步骤？ 3．实验操作中有哪些关键步骤和因素影响所得细 胞器的含量和纯度？