江苏师范大学生命科学学院 《卓培班》 微生物学实验 吕爱军 2013年3月

基础综合实验一 1.培养基的制备及高压蒸汽灭菌 2. 器皿的清洗包装及干热灭菌 3. 实验室环境和人体表面微生物的检查 4. 无菌接种技术

1.培养基制备及高压蒸汽灭菌 培养基配方： 牛肉膏 0.3g 蛋白胨 1g NaCl 0.5g 琼脂 2g 水 100ml PH 7.2-7.4 培养基配方： 牛肉膏蛋白胨固体培养基：加1.5-2％琼脂 400ml 牛肉膏蛋白胨培养基：液体培养基 200ml

(1)培养基的配制： 称量---溶解----调节pH值----过滤----分装及包扎----灭菌----灭菌后试管摆放斜面、倒平板 先将试管贴好标签。注明培养基名称，组别，日期。标签粘贴位置在离管口1/3管身处。 注意：标签用铅笔书写，以防高温灭菌时蒸汽模糊字迹。 操作图示： 称量---溶解----调节pH值----过滤----分装及包扎----灭菌----灭菌后试管摆放斜面、倒平板

(2) 高压蒸汽灭菌 一般培养基用0.1Mpa，121.5℃,15～30min 实验步骤： 灭菌时间到后 压力降为零 装待灭 加水 加盖 断电源 压力降为零 开箱取物 加水 装待灭 菌物品 加盖 加热

摆斜面

倒平板 将菌液分离样品摇匀，用无菌移液管取1 ml的菌液移至无菌培养皿中，然后将融化，凉至50℃左右的培养基，在每个培养皿内各倒入约15 ml，摇匀，凝固，制成平板。

2. 器皿的清洗包装 及干热灭菌 (1) 培养皿、三角锥瓶、试管的包扎

(2)干热灭菌法 所需温度(160-170℃)，时间长(1-2h)。 实验步骤: 装入待灭菌物品 升温 恒温 降温 开箱取物

3. 实验室环境和人体 表面微生物的检查 (1)写标签： 在皿底上 (2)接种环境或体表微生物 3. 实验室环境和人体 表面微生物的检查 (1)写标签： 在皿底上 (2)接种环境或体表微生物 手指（洗前后）、头发、咳嗽、抹布、空气、硬币等 (3)培养：37 ℃培养24h-48h

4. 微生物接种技术 常用的几种方法如下： 斜面接种 液体接种 平板接种

1)斜面接种示意图

2)平板划线法： 将菌液分离样品摇匀，以无菌操作用接种环直接取试管中待分离纯化的菌液，将接种环通过稍打开皿盖的缝隙（约30℃）伸入平板，将菌液点种在平板边缘一处，取出接种环，烧去多余的菌种，在平板边缘空白处接触一下使接种环冷却,然后从接种有菌的部位在平板上自左向右轻轻划线，划线时平板面与接种环面成30-40℃，以手腕力量在平板表面轻巧滑动划线,接种环不要嵌入培养基内划破培养基,线条要平行密集，充分利用平板表面积，注意勿使前后两条线重叠，划线完毕，关上皿盖.灼烧接种环，待冷却后放置接种架上。

基础综合实验二 1.细菌的单染色 2. 革兰氏染色 芽孢染色 4. 酵母菌形态观察、死活细胞鉴别

1.细菌的单染色 现场演示 无菌操作 涂片 干燥 固定 染色 水洗 干燥 镜检

显微镜保养和使用中的注意事项 1.不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏。 2.镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度 3.观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用油镜。当目视接目镜时，特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器，以免压碎玻片或损伤镜面。 4.拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座，不可单手拿，更不可倾斜拿。

显微镜操作 1.低倍镜观察：粗调、细调。依次再进行中倍、高倍观察 2.油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象后，提升聚光镜，在标本中央滴一滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏油中，细调至看清物象为止。 3.换片：另换新片，必须从第一条开始操作。 4.用后复原：观察完毕，上悬镜筒，先用擦镜纸擦去镜头上的油，然后再用擦镜纸沾取少量去污剂擦去残留的油，最后用擦镜纸擦去残留的二甲苯，后将镜体全部复原。 注意：油镜使用完毕后一定要用去污剂擦拭镜头

2. 革兰氏染色 （1）初染：于制片上滴加结晶紫染液，染1min后，用水洗去剩余染料。 （2）滴加卢戈氏碘液，1min后水洗： （3）滴加95％乙醇脱色，摇动玻片至紫色不再为乙醇脱退为止(根据涂片之厚薄需时30s至1min)。 （4）复染 滴加石炭酸复红液复染1min，水洗。 （5）用滤纸吸干，油镜镜检。 制片→初染（结晶紫1min）→水洗→媒染（碘液1min）→水洗→脱色（乙醇20-30s）→水洗→复染（番红2min）→水洗→干燥→观察

3.芽孢染色法 (1)取37℃培养18～24h的枯草芽孢杆菌作涂片，并干燥，固定。 (2)于载片上滴入3～5滴5％孔雀绿水溶液。 (3)用试管夹夹住载玻片在火焰上用微火加热，自载玻片上出现蒸汽时，开始计算时间约4～5min。加热过程中切勿使染料蒸干，必要时可添加少许染料。 (4)倾去染液，待玻片冷却后，用自来水冲洗至孔雀绿不再褪色为止。 (5)用0.5％沙黄水溶液(或0.05％碱性复红)复染1min，水洗。 (6)制片干燥后用油镜观察。芽孢呈绿色，菌体红色。

制片→染色（孔雀绿5min）→水洗→复染（蕃红花红2-3min）→水洗→干燥→镜检 切勿煮干 芽孢染色 制片→染色（孔雀绿5min）→水洗→复染（蕃红花红2-3min）→水洗→干燥→镜检

4.酵母菌形态观察、 死活细胞鉴别（美蓝浸片） 染液不宜过多或过少 盖玻片不宜平着放下 在载玻片中央加一滴0.1％吕氏碱性美蓝染色液，用接种环挑取少量酵母菌苔放入上述液滴里，混合均匀； 盖玻片不宜平着放下 用镊子取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下使其盖在菌液上；

将制片放置约3min，先低倍镜后高倍镜观察酵母形态和出芽情况，并根据颜色区别死活细胞。 用0.05％的吕氏碱性美蓝染色液重复上述操作。

综合设计实验三 1.细菌的分离鉴定； 2.细菌生理生化试验； 3.药敏试验； 4.16S rRNA基因的克隆测序。