HPLC的介紹
HPLC原理流程圖
在層析分離法中，組成複雜的物質皆溶於一個動相，它可以是一種液體、氣體或是超臨界流體。此動相接著被迫流入一個不互溶的靜相中，它已被固定於管柱內或一表面上。 這兩相的選取乃為了使樣品中的成份在動相靜相間有不同程度的分佈。那些被靜相強制滯留的成份，隨著流動相緩慢的流動。相對地，成分若僅能微弱的靜相抓住，則其移動速度會很快。由於流率不同結果，樣品成份乃分離成若干不連續的層帶，因此可進行而做定性或定量分析。
在正相層析法中，最低極性的成分最先流析出來，相對的在動相中最能溶解；動相極性增加有減少流析時間的效應。在逆相層析法中最高極性的成分最早出現，且動相極性增加就會增加流析時間。表1-1所示為正相與逆相兩種層析之特性比較，由於液相層析牽涉到待測成份、固定相、移動相三者間互相作用，因此如何強化固定相與移動相間化學作用特性差異，是決定待測成份滯留有高度選擇性的重要關鍵。
種類 Normal phase Reverse phase 固相極性 高極性 低極性 移動相極性 先流析出來分析物 移動相極性增加 種類 Normal phase Reverse phase 固相極性 高極性 低極性 移動相極性 先流析出來分析物 移動相極性增加 流析時間增加 流析時間減少 表一、正相層析與逆相層析之特性比較
層析管柱的選擇要領： (1)適合分析液相之樣品。 (2)可分析之樣品一般較大且因注入樣品量及其應用方式之差異可有很多種管柱尺寸供選擇。 (3)可使用移動相因所使用的管柱種類及待分析化合物特性而有很多種。 (4)需了解待測化合物的結構及其所含的特殊官能基以方便管柱選擇。
除氣泡裝置 HPLC所使用的溶劑通常會溶解氧氣與氮氣，所以要把氣泡去除才不會影響系統，氣泡會影響幫浦的運作、管柱的分離效率、檢測器的靈敏度、基線穩定性，還有可能會影響溶劑的pH值造成分析結果的誤差。
除氣泡方法 真空、超音波震盪、加熱煮沸、吹氦氣等。最常被大家所使用的方法，抽真空與超音波震盪。
幫浦裝置 幫浦裝置，是HPLC重要零件之一，幫浦的好壞會直接影響到整個系統。幫浦應該具有下列幾種性能：流量穩定、流量範圍大、壓力範圍大、密封效果高、耐腐蝕。
幫浦裝置注意事項 禁止任何微粒進入幫浦，因為任何微粒進入幫浦都會造成磨耗，所以要再進入幫浦前先行過濾，以免造成幫浦損壞。 移動相不應該具有腐蝕性物質，緩衝溶液不應該保留在幫浦中。如果留在幫浦中，因為蒸發或洩露可能會有析出結晶體，這些晶體就如同微粒，也會造成損害。因此必須用純水將幫浦充分清洗，在更換成適合保存的溶劑(例如：甲醇)。 幫浦在運作時，要注意移動相的存量，如果移動相被用完那這樣就會吸到空氣，空轉幫浦也是會造成傷害；注意這些小地方可以使幫浦的壽命延長。
樣品注射裝置 主要是讓樣品進入HPLC中進行分析的重要裝置，目前分為手動注射與自動注射兩種。自動注射越來越多人使用，是因為淘汰舊式管路的傳送方式以減少樣品損失、準確的注射量、確保注射針乾淨、編排樣品程序、操作簡單等，而提升使用者的效率。
層析管柱 層析管柱是整個系統最重要的核心部分，管柱的長短、內徑大小、填充物的材質與顆粒大小，都會對整個系統有影響。正常管柱的壽命為兩年以上，填充物質都以二氧化矽為基底，再接上不同的官能基而有不同的分離能力，最適當的 pH 值範圍是2~9，根據不同的官能基可以分成正相層析管柱與逆相層析管柱，填充物鍵結表面為極性物質稱為正相，反之填充物鍵結表面為非極性為逆相。
管柱的注意事項 需避免壓力和溫度的突然改變與震動。 調整移動相比例時，應避免有機溶液與水之比例調整過大，需慢慢改變。 禁止管柱逆相沖提。 選擇適當移動相，以免破壞管柱內的固定相。 避免將複雜之樣品直接注入HPLC進行分析，以免管柱卡死。 經常使用溶解度較大的溶液清洗管柱，以清除管柱內的雜質。 不使用HPLC時，需選擇適當溶液來保護管柱。
檢測器 檢測器式層析儀器中最關鍵的一個裝置，主要是把溶在溶劑中的成份轉換成電子訊號傳送到電腦中，檢測器的要求有以下幾點靈敏度高、雜訊低、基線平穩、溫度無影響檢測、線性範圍高、再現性高；好的檢測器除了要上述條件外，還要有檢測極限，這是判斷好壞的主要指標，數值越小，性能越好。
HPLC的原理 高效液相層析儀根據各種各樣的化工互作用力來分離混合物。這種互作用力通常是分析物及分析管柱之間的一種非共價性質。使用高效液相層析時，液體待檢測物在不同的時間被注入色譜柱，通過壓力在固定相中移動，由於被測物種不同物質與固定相的相互作用不同，不同的物質順序離開色譜柱，通過檢測器得到不同的峰信號，每個峰頂都代表一個另外化合物的種類，最後通過分析比對這些信號來判斷待側物所含有的物質。
HPLC的用途 適於分析高沸點不易揮發、分子量大、不同極性的有機化合物。例如：可檢測分析食品中的三聚氰胺的含量。 高效液相層析作為一種重要的分析方法，廣泛的應用於化學和生化分析中，常用於醫藥品、化學、環保、生命科學、與食品工業的研究上。 適於分析高沸點不易揮發、分子量大、不同極性的有機化合物。例如：可檢測分析食品中的三聚氰胺的含量。