分解纤维素的微生物的分离.

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1 分解纤维素的微生物的分离

2 一、纤维素和纤维素酶 1、纤维素在生物圈的分布状况？ 2、纤维素酶的组成及作用？
阅读课本27页基础知识部分第一、二段，回答下列问题： 1、纤维素在生物圈的分布状况？ 纤维素是地球上含量最丰富的多糖类物质。植物的根、茎、叶等器官都含有大量的纤维素。其中棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物。 2、纤维素酶的组成及作用？ 纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即CX酶、 C1酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。

3 二、纤维素分解菌的筛选 阅读课本课本28页相关部分，回答下列问题： 1、纤维素分解菌的筛选方法 2、纤维素分解菌的筛选方法的原理
刚果红染色法：这种方法能够通过颜色反应直接 对微生物进行筛选 2、纤维素分解菌的筛选方法的原理 (1)刚果红可以与纤维素形成红色复合物，但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。 (2)纤维素分解菌能产生纤维素酶分解纤维素，从而使菌落周围形成透明圈。

4 即：可根据是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。
①实验原理 即：可根据是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。

5 三、实验操作 土壤取样 选择培养 梯度稀释 将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上 挑选产生透明圈的菌落

6 (1)方案 土壤取样→选择培养→梯度稀释→将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上→挑选产生透明圈的菌落。 (2)选择培养的目的：增加纤维素分解菌的浓度，确保能够从样品中分离到所需要的微生物。 (3)涉及到的微生物技术主要有：培养基的制作、无菌操作技术、稀释涂布平板法、选择培养基的作用、土壤取样等。

7 1、本实验的流程与课题2中的实验流程有哪些异同？
答：本实验流程与课题2的流程的区别如下。课题2是将土样成的菌悬液直接涂布在以尿素为惟一氮源的选择性培养基上，直接分离得到菌落。本课题通过选择培养，使纤维素分解菌得到增殖后，再将菌液涂布在选择培养基上。其他步骤基本一致. 2.为什么要在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌？ 答：由于生物与环境的相互依存关系，在富含纤维素的环境中，纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土样中获得目的微生物的几率要高于普通环境。 3.将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应该埋进土壤多深？ 答：将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对聚集，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。一般应将纸埋于深约10 cm左右腐殖土壤中。

8 土壤取样 取样的环境是怎样的，作出这种选择的理由是什么？ 选择纤维素丰富的环境，如树林中多年落叶形成的腐殖土，多年积累的枯枝败叶等等。
生物与环境的互相依存关系，在富含纤维素的环境中纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土壤中获得目的微生物的几率要高于普通环境

9 选择培养 1、选择培养的目的： 2、制备选择培养基 参照课本29页旁栏中的比例配置，回答下列问题
增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离到所需要的微生物. 2、制备选择培养基 参照课本29页旁栏中的比例配置，回答下列问题 a、旁栏中的配方是液体培养基还是固体培养基？为什么？ 是液体培养基，原因是配方中无凝固剂 b、这个培养基对微生物是否具有选择作用？如果具 有，是如何进行选择的？ 有选择作用，本配方中的碳源是纤维素，所以能分解纤维素的 微生物可以大量繁殖. c、你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用 用牛肉膏蛋白胨培养基与之对照

10 思考：为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物？
3、操作方法： 将土样加入装有30ml选择培养基的锥形瓶中，将锥形瓶固定在摇床上，在一定温度下震荡培养1～2天，直至培养液变浑浊。也可重复选择培养 思考：为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物？ 在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“浓缩”的作用.

11 梯度稀释 按照课题1 的稀释操作方法，将选择培 养后的培养基进行等比稀释，稀释最大倍数 到106

12 将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上 1、制备培养基:参照旁栏中的比例
2、涂布平板：将稀释度为104～106的菌悬液各取0.1ml涂布在培养基上，30℃倒置培养

13 挑选产生透明圈的菌落 参照课本刚果红染色法，挑选产生透明圈的菌落，一般即为分解纤维素的菌落

14 思考：这两种方法各有哪些优点与不足 刚果红染色法 方法一：先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应 方法二：在倒平板时就加入刚果红
方法一 缺点是操作烦琐，加入刚果红溶液会使菌落之间发 生混杂；优点是这样显示出的颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用 方法二 优点是操作简便，不存在菌落混杂问题 缺点一是由于培养基中还含有淀粉类物质，可以使能产生淀粉酶的微生物出现假阳性反应；缺点二有些微生物具有降解色素的能力，它们在长时间培养过程中会降解刚果红，形成明显的透明圈，与纤维素分解菌不易区分.

15 4、想一想，这两种方法各有哪些优点与不足？你打算选用哪一种方法？
染色法 优点 缺点 方法一 颜色反应基本 上是纤维素分 解菌的作用 操作繁琐刚果红会使菌落之 间发生混杂 方法二 操作简便 不存在菌落混 杂问题 产生淀粉酶的微生物也产生 模糊透明圈，有些微生物能 降解色素，形成明显的透明圈。

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17 四、结果分析与评价 （二）分离的结果是否一致 如果不同，分析产生不同结果的原因。
（一）培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选出菌落 设置对照，若对照的培养基在培养过程中无菌落生长则说明培养基制作合格。如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得了分解纤维素的微生物。 （二）分离的结果是否一致 如果不同，分析产生不同结果的原因。 由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌的数量，因此最容易分离得到的是细菌。但由于所取土样的环境不同，学生也可能得到真菌和放线菌等不同的分离结果。

18 五、课题延伸 本课题对分解纤维素的微生物进行了初步的筛选，但是这只是分离纯化的第一步。为确定得到的是纤维素分解菌，还需要进行发酵产纤维素酶的实验，纤维素酶的测定方法一般是对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖进行定量的测定。 3．1为了确定分离得到的是纤维素分解菌，还需要进行 发酵产纤维素酶 实验，纤维素酶的发酵方法有 液体 发酵和 固体 发酵。 3．2纤维素酶测定方法是对纤维素酶分解滤纸等纤维素所产生的 葡萄糖 含量进行定量测定。

19 1．纤维素分解菌的选择培养基为液体培养基，因培养基中无凝固剂，利用液体选择培养基以增加纤维素分解菌的浓度。
2．为确定得到的菌是否是纤维素分解菌，还需进行发酵产纤维素酶的实验。纤维素酶的发酵方法有液体发酵和固体发酵两种。纤维素酶的测定方法，一般是对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖进行定量测定。 3．流程中的“选择培养”是否需要，应根据样品中目的菌株数量的多少来确定。