Diagnosis of Genetic Disease

本章节重点 本章节重点  遗传病特有的诊断方法？ 及其应用范围？  染色体检查适应症  基因诊断  产前诊断

产前诊断 ( prenatal diagnosis ) ( prenatal diagnosis ) 症状前诊断 ( presymptomatic diagnosis ) ( presymptomatic diagnosis )现症病人诊断 ( symptomatic diagnosis ) ( symptomatic diagnosis ) 遗传病诊断的分类

第一节 病史、症状和体征 1. 症状和体征：遗传病有其它疾病相同的体征和 症状，往往又有其本身特异性症候 群，为诊断提供初步线索。 2. 病史采集：遗传病多有家族聚集现象，所 以 采集病史除一般病史外，应着重患 者的家族史、婚姻史和生育史。

1. 系统、完整 第二节 系谱分析 2. 去伪存真 3. 新的基因突变 系谱分析可以有效地记录遗传病的家族 史，确定遗传病的遗传方式，还能用于遗传 咨询中个体患病风险的计算和基因定位中的 连锁分析。

一、孟德尔式遗传病 ---- 单基因病 1. 基因多效性 (AD) 2. 遗传异质性 (AR) 二、非孟德尔式遗传病 1. 线粒体遗传病 2. 多基因病

1. 遗传印记 2. 动态突变 3. 修饰基因 4. 单亲二体性 5. 性别 三、特殊遗传方式 二、非孟德尔式遗传病 一、孟德尔式遗传病

一、 染色体检查： 染色体检查亦称核型分析 （ karyotype analysis ）是确诊染色体病的主要方法。 一、 染色体检查： 染色体检查亦称核型分析 （ karyotype analysis ）是确诊染色体病的主要方法。 ( 一 ) 、染色体检查标本的来源：主要取自患者的外周 血和身体的各种组织；胎儿的绒毛、羊水中胎儿脱落 细胞和脐血、受精卵卵裂细胞、皮肤等各种组织。 第三节 细胞遗传学检查

（二）、染色体检查 的适应症： 1. 智力发育不全、生长迟缓或伴有其它先天畸形者； 2. 夫妇中有染色体异常，如平衡易位、嵌合体等； 3. 家族中已发现染色体异常或先天畸形个体； 4. 多发性流产的妇女及其丈夫； 5. 原发闭经和男女不育者； 6.35 岁以上的高龄孕妇； 7. 有两性内外生殖器畸形者；

（三）、方法：外周血淋巴细胞染色体制备 （四）、临床诊断标准： 15 个分裂相，其中有 2 个异常将增倍。不仅 对染色体的情况作出正确诊断，还要了解患 者异常染色体的来源，而且对生育第二胎提 供咨询。

二、性染色质检查： 优点是方法简单，主要用于疑为两性畸 形或性染色体数目异常的疾病诊断或产前诊 断，有一定价值，但确认仍需依靠染色体检 查。 1. X 染色质检查 2. Y 染色质检查

三、染色体荧光原位杂交 (FISH) ： 应用标记的特异性 DNA 探针与玻片上的 细胞中期染色体或间期核的 DNA 进行 FISH 检测可完成非整倍体的检测。 应用标记的特异性 DNA 探针与玻片上的 细胞中期染色体或间期核的 DNA 进行 FISH 检测可完成非整倍体的检测。 二、性染色质检查 一、染色体检查 —— 核型分析

X 染色体 Y 染色体 13 号染色体 18 号染色体 21 号染色体

13 号染色体 21 号染色体

基因突变引起的单基因病往往表现在酶和蛋白质的质和量的 改变或缺如。因此，酶和蛋白质的定性定量分析是诊断单基因 病或分子代谢病的主要方法。 1 ）对酶和蛋白质的检查 ① 蛋白质的检查：血液。异常的血红蛋白 ② 酶的检查：肝、肾、皮肤、甲状腺、肠粘膜。 A B C 酶 第四节 生物化学检查 酶

苯丙酮尿症（ PKU) （ AR) 病因：肝中苯丙氨酸羟化酶 缺乏, PAH 基因 12q24 13 个外显子 苯乙酸 苯乙酰谷氨酰氨 L- 谷氨酸 脱羧酶 r 氨基丁 酸减少 抑制 5- 羟色氨 脱羧酶 5- 羟色氨 减少 抑制 影响大脑的发育 2 ）代谢产物检查：如：苯丙酮尿症

分子代谢病可以从三个层次检测和分析 1 ．酶和蛋白质的分析：基因突变引起的单基因病主要是特定 的酶和蛋白质的质和量改变的结果。 2 ．代谢产物的检测：酶缺陷导致一系列生化代谢紊乱，从而 使代谢中间产物、底物、终产物旁路代谢产物发生变化。因此， 检测某些代谢产物的质和量的改变。可间接反映酶的变化而作 出诊断。 3 ．基因分析 ：基因诊断（ gene diagnosis ）是利用 DNA 分析技 术直接从基因水平（ DNA 或 RNA ）检测遗传的基因缺陷。

上海： 1981 ～ 1987 年对 284,396 名新生儿进行 PKU 筛查，查出 PKU 患儿 15 名，高苯丙氨酸血 症 4 名。

第五节 基因诊断 定义 2 、基因诊断的定义 思路 3 、基因诊断的思路 发展简史 1 、基因诊断的发展简史 4 、基因诊断的原理 5 、基因诊断的方法

在第 18 届国际遗传学大会上，全世界 3000 名科学 家对人类的生老病死做了新诠释 ——“ 不论是器质性 疾病还是功能性疾病，都有必要在基因水平上去探 究病因 ” 。除此之外，人类正常的发育、衰老和死亡， 当然也受基因的调控。 ” 发展简史： 1 、基因诊断的发展简史：

1978 年， Kan YW —— 镰状细胞贫血 症状前诊断 —— 外周静脉血 产 前诊 断 —— 孕早期的绒毛细胞 孕中期的羊水胎儿脱落细胞 孕中期的羊水胎儿脱落细胞 母亲外周血中的胎儿有核红细胞 母亲外周血中的胎儿有核红细胞 植入前诊断 —— 受精卵卵裂细胞

定义： 应用分子生物学方法检测患者体内遗传物 质的结构和功能变化而作出的或辅助临床诊断的技 术，称为基因诊断。 定义： 应用分子生物学方法检测患者体内遗传物 质的结构和功能变化而作出的或辅助临床诊断的技 术，称为基因诊断。 思路：用一段已知基因的核酸序列作出探针，与 变性后的单链基因组 DNA 接触时，如果两者的碱基 完全配对，它们即互补地结合成双链，从而表明被 测基因组 DNA 中含有已知的基因序列。 思路：用一段已知基因的核酸序列作出探针，与 变性后的单链基因组 DNA 接触时，如果两者的碱基 完全配对，它们即互补地结合成双链，从而表明被 测基因组 DNA 中含有已知的基因序列。

和传统的诊断方法主要差异在于直接从基因型推断表型， 即可以越过产物（酶和蛋白质）直接检测基因结构而作出诊断， 这样就改变了传统的表型诊断方式，故基因诊断又称为逆向诊 断（ reverse diagnosis ）。 和传统的诊断方法主要差异在于直接从基因型推断表型， 即可以越过产物（酶和蛋白质）直接检测基因结构而作出诊断， 这样就改变了传统的表型诊断方式，故基因诊断又称为逆向诊 断（ reverse diagnosis ）。 这一诊断方法不仅可对患者，还可以在发病前作出症状前 基因诊断，也可对有遗传病风险的胎儿作出生前基因诊断。此 外基因诊断不受基因表达的时空限制，也不受取材的细胞类型 和发病年龄的限制。这一技术还可以从基因水平了解遗传病异 质性，有效地检出携带者。因此近年来这一技术日新月异地迅 速发展，并已经在遗传病诊断中发挥了巨大作用。 这一诊断方法不仅可对患者，还可以在发病前作出症状前 基因诊断，也可对有遗传病风险的胎儿作出生前基因诊断。此 外基因诊断不受基因表达的时空限制，也不受取材的细胞类型 和发病年龄的限制。这一技术还可以从基因水平了解遗传病异 质性，有效地检出携带者。因此近年来这一技术日新月异地迅 速发展，并已经在遗传病诊断中发挥了巨大作用。

基因诊断的原理 核酸分子杂交是基因诊断的最基本的方法之一。 基本原理是：互补的 DNA 单链能够在一定条件下 结合成双链，即能够进行杂交。 这种结合是特异的，即严格按照碱基互补的原 则进行，它不仅能在 DNA 和 DNA 之间进行，也能 在 DNA 和 RNA 之间进行。

进行基因检测有两个必要条件： 一、是必需的特异的 DNA 探针； 二、是必需的基因组 DNA 。 当两者都变性呈单链状态时，就能进行 分子杂交。

基因探针的定义： 基因探针的来源： 基因探针的标记：

基因探针的定义： 基因探针（ probe ）就是一段与目的基 因或 DNA 互补的特异核苷酸序列。它可以包 括整个基因，也可以仅仅是基因的一部分； 可以是 DNA 本身，也可以是由之转录而来的 RNA 。

1 、来自基因组中有关的基因本身，称为基因组探 针（ genomic probe ）。 2 、是从相应的基因转录获得了 mRNA ，再通过逆 转录得到的探针，称为 cDNA 探针（ cDNA probe ）。与基因组探针不同的是， cDNA 探针不 含有内含子序列。 3 、可在体外人工合成碱基数不多的与基因序列互 补的 DNA 片段，称寡核苷酸探针。长约 20 个 bp 左 右。 探针的来源：

探针的标记：放射性同位素标记 （ 32 P 、 35 S ）、地高辛、辣根过氧化 物酶、生物素。 方法：缺口平移法、六核苷酸引物 标记法。 基因探针的标记：

一、分子杂交 1. Southern 印迹杂交 1. Southern 印迹杂交

一、分子杂交 1. Southern 印迹杂交 1. Southern 印迹杂交 2. ASO 杂交 2. ASO 杂交

1 、 Southern 杂交法 细胞 提取目的基因 限制性内切酶消化 琼脂糖凝胶电泳 观察分析 探针杂交 放射自显影

Southern 印迹杂交 -+

一、分子杂交 1. Southern 印迹杂交 1. Southern 印迹杂交 2. ASO 杂交 2. ASO 杂交二、聚合酶链式反应

聚合酶链反应： （ polymerase chain reaction, PCR ） 原理： 1 ）引物的设计：合成 2 个与目的 DNA 序列两侧互补的 寡核苷酸，一般长约 15-25bp 。 2 ）基本条件：引物、 DNA 前体物质、含有一定离子（ Mg ）的反应体系 、 DNA 聚合酶、模板。 3 ）三段循环：变性： ；复性： 延伸： 。 n 个周期， 2 n 个 DNA

聚合酶链反应 （ polymerase chain reaction,PCR ） PCR 原理

１变性

PCR 原理 １复性

PCR 原理 １延伸

PCR 原理 ２变性

PCR 原理 ２复性

PCR 原理 ２延伸

PCR 原理 ３变性

PCR 原理 ３复性

PCR 原理 ３延伸

预变性 (93-95  C,2-5m) 变性 (93-95  C,30s) 复性 (50-70  C,30s) 延伸 (75  C,30-60s) 总延伸 (75  C,7m) (25-35) PCR 的一般过程： 经过 30 次的循环, 扩增的 DNA 片段可达 100 万倍以上。

PCR 技术的研究应用 1. 基因组克隆 2. 反向 PCR 3. 不对称 PCR 4. RT-PCR 等等

１. 直接分析法 １. 直接分析法  A  A  A  S  S  S Mst Ⅱ： CCTNAGG 1.2 Kb 0.2Kb 1.2 Kb 0.2Kb 1.40 Kb 1.20 Kb 0.20 Kb 镰状细胞贫血 (HbS) ： 第 5 ～ 7 位密码子  A ： CCT GAG GAG  S ： CCT GTG GAG 三. 基因诊断的途径和方法

２.RFLP 连锁分析 4.7Kb 3.0Kb 神经纤维瘤， NF 1 RFLP 标记 ⅠⅡⅢ

３.ASO 斑点杂交 1986 年，胡流清等基于点突变原理，用寡核 苷酸探针进行基因诊断。 正常探针突变探针 Back PKU ， AR

四. 基因诊断检测的临床应用

基因诊断在肿瘤检测中的应用：在许多肿 瘤中存在的：癌基因 ras 、 myc 等的突变；抗 癌基因 P53 、 Rb 等的突变、丢失的检出。 基因诊断在个体识别中的应用：亲子鉴定、 个体识别、法医物证。

产前诊断（ prenatal or antenatal diagnosis ）又称 宫内诊断（ intrauterine diagnosis ）是对胚胎或胎儿 在出生前是否患有某种遗传病或先天畸形作了准确的 诊断。 产前诊断（ prenatal or antenatal diagnosis ）又称 宫内诊断（ intrauterine diagnosis ）是对胚胎或胎儿 在出生前是否患有某种遗传病或先天畸形作了准确的 诊断。 产前诊断的适应症的选择原则： 一、是有高风险而危害较大的遗传病 二、是目前已有对该病进行产前诊断的手段。 第六节 产前诊断

产前诊断的适应症 : 产前诊断的适应症 : 1 、染色体病：夫妇之一有染色体异常、生育过染 色体病的患儿夫妇之一为平衡易位携带者、脆性 X 家系的孕妇。 2 、单基因病：特定酶缺陷所致的遗传性代谢病。 3 、多基因病： NTD 4 、不明原因的自然流产史、畸胎史、死产、新生 儿死亡、羊水过多； 35 岁以上孕妇、有明显制畸史 的孕妇。 5 、有明显形态改变的先天畸形。

主要产前诊断方法 1 、超声波检查：是一项简便对母体无痛无损伤的 产前诊断方法。 B 型超声波应用最广，利用超声波能作 出的产前诊断或排除性诊断。此外还可直接对胎心和 胎动进行动态观察，并可摄象记录分析，亦可作胎盘 定位，选择羊膜穿刺部位，可引导胎儿镜操作，采集 绒毛和脐带血标本供实验室检查。 范围：多胎妊娠、羊水过多、 NTD 、脑积水、多囊 肾、肢体短小； 18 周测性别： XR 男性选择性流产。

2 、 X 线检查 ：主要用于检查 24 周以后胎儿骨骼先 天畸形。但因 X 线对胎儿有一定影响，现已极少使用。 3 、胎儿镜 （ fetoscope ） ：又称羊膜腔镜或宫腔 镜，是一种带有羊膜穿刺的双套管光导纤维内窥镜。 能直接观察胎儿，可于怀孕 15 － 21 周进行操作。由 于 B 超的应用，此方法易引起流产、母体免疫反应， 已少用。 范围： 各种类型的地中海贫血、 DMD

4 、羊膜穿刺 ：（ amniocentesis ）亦称羊水取样。 最佳时间：是妊娠 16 － 18 周。 范围：经体外培养后，可进行染色体分析、酶和蛋白 质检测、性染色质检查、提取 DNA 作基因分析，也可 不经培养，用微量技术作酶和蛋白质分析或直接提取 DNA 作基因诊断。

方法： B 超、腰穿针穿刺、穿过腹壁和子宫壁进 入羊膜腔。 20-30ml 。

应用： 1 、生活的脱落细胞。 -- 染色体分析、酶和蛋白质 检测、性染色质检查、提取 DNA 作基因分析 检测、性染色质检查、提取 DNA 作基因分析 2 、羊水： AFP 、乙酰胆碱脂酶。 2 、羊水： AFP 、乙酰胆碱脂酶。

5 ．绒毛吸取：绒毛取样（ chorionic villi aspiration sampling,cvs ） 方法：绒毛可经宫颈 部取样，最好在 B 超 监视下进行。绒毛枝 经处理（与蜕膜严格 分离）或经短期培养。

时间：一般于妊娠 周时进行。 范围：染色体分析、酶和蛋白质检测和直接抽取 DNA 进行基因分析。 优点：时间早。 6 ．脐带穿刺术（ cordocentesis ）： 经母腹抽取胎儿静 脉血，可在 B 超引导下于孕中期、孕晚期（ 周）进行。 脐血可作染色体或血液学各种检查，亦可用于因羊水细胞 培养失败， DNA 分析无法诊断而能用胎儿血浆或血细胞进 行生化检测的疾病，或在错过绒毛和羊水取样时机下进行， 在一些情况下，可代替基因分析。

胎儿的表型形态特征、分析 蛋白质和酶的正常与否、检查染 色体核型、鉴定基因。

第七节 皮肤纹理分析 一、正常皮肤纹理 （一）指纹 （二）掌纹 （三）指摺纹和手掌摺纹 （四）脚掌纹

二、染色体病患者皮肤纹理特征 类型正常 21 三体 18 三体 13 三体 指纹类型 弓形纹 尺箕 桡箕 斗形纹 掌纹类型 三叉 t’ 通贯手

复习题 、产前诊断、核型分析、 1 、名词：基因诊断、产前诊断、核型分析、 临床表型杂合子 (XR) 临床表型杂合子 (XR) 2 、遗传病特有的诊断方法有哪些？ 其应用 范围如何？ 3 、染色体检查适应症。