植物细胞组织培养

植物组织培养成绩评定原则(10分) 实验结果成绩（4分) 烟草快速繁殖（3分） 豌豆茎尖剥离与培养(1分) 实验报告成绩(6分)

一、实验目的 1、通过本实验学习常规的组织培养技术，感受、了解无菌操作过程。 2、在实践中加深对植物细胞的全能性的认识。 3、感悟基础理论对实践的指导作用。

二、实验材料和仪器 实验材料 ： 烟草无菌苗、豌豆幼苗 仪器设备 （1） 酒精灯、100ml三角烧瓶，培养皿； （2） 镊子、剪刀、解剖针； （3） 体视显微镜； （4） 光照培养箱或温室 试剂 （1） MS培养基； （2） 植物激素：NAA、6-BA等； （3） 饱和漂白粉（次氯酸钠）溶液； （4） 70%酒精、100%酒精、酒精棉球； （5） 无菌水

实验材料 烟草（Nicotiana）属茄科植物，是重要的工业原料，是组织培养中研究的最为广泛的植物材料。 豌豆（Pisum sativum）属豆科植物，是粮食、饲料和重要的蔬菜作物，豌豆的根、茎、子叶、下胚轴、上胚轴、花芽等外植体，皆可形成愈伤组织，其中茎尖、幼胚、幼叶等器官可成功地再生成植株。

有菌豌豆苗 无菌烟草苗

组 培 实 验 用 品

三、实验原理 １、植物的全能性： 植物体的任何一个细胞都具有生长分化成为一个完整植株的能力，称为植物的全能性。植物组织培养就是利用植物的全能性进行离体无菌植物培养的一门技术。

单细胞 通过植物细胞全能性 进行植物组织培养快速繁殖

2、植物组织培养的发展 1904年，德国植物胚胎学家Haning用萝卜和辣根的胚进行培养，首次获得组培的成功。 1922年，豌豆、玉米和棉花的茎尖培育获得成功。 1933年，我国李继侗等进行银杏离体胚培养获得成功。

3、植物组织培养的应用 在作物育种上的应用（单倍体植株、种间杂交、细胞融合、细胞突变、种质保存和基因工程） 在作物脱毒和快速繁殖上的应用 在遗传、生理生化和病理研究上的应用

利用植物细胞组织培养技术进行种间的杂交育种

通过植物组织培养技术对胡萝卜的快速繁殖

快速繁殖得到的个体均匀一致

马铃薯脱毒技术 染毒薯 脱毒组培 无毒培养 无毒薯

草莓脱毒技术

4、植物组织培养的内容 植物组织培养包括以植物和它的离体器官、组织、细胞和原生质体几种不同水平的离体无菌培养，即整体的、器官的、组织的、细胞和原生质体的培养技术。 （植株培养、胚胎培养、器官培养、组织培养、细胞培养、原生质体培养 ）

长春花的胚性细胞培养

石斛植物的芽培养

黄芪的发状根培养

石竹的植株培养

5、植物组织培养中的重要概念 外植体：植物组织培养中用来进行无菌培养的离体材料，可以是器官、组织、细胞和原生质体等；

愈伤组织：指由植物的一种组织或器官经历脱分化形成的原始胚样组织，它具有再分化成为完整植物体的潜能； 烟草愈伤组织

6、实验过程中要体会和感悟的概念 无菌 消毒 湿热和干热灭菌 超净工作台

四． 实验要求： 1、实验开始前，所有同学将自己的实验台擦洗一遍，同组两位同学请先认真研究好实验步骤，明确合作和分工，以加快实验速度，减少染菌机会，实验开始后，请尽量不要走动，有事请举手。

2、无菌操作要注意： 每次操作前，将双手用酒精棉球擦拭消毒； 解剖针、剪刀等金属工具用火焰烧过灭菌，在酒精中冷却，再将酒精烧去方可使用； 尽量减少无菌三角瓶和培养皿在空气中的暴露时间； 所有无菌操作尽量快速完成，并请在酒精灯附近进行。

3、请先用带菌豌豆练习茎尖解剖，经检查无误，操作熟练后，再进行无菌解剖及接种，以减少植物材料染菌或失水死亡的机率。

五．实验内容（两人一组） １、烟草无菌苗的快速切繁—— 继代培养 2、豌豆苗的茎尖培养

点着酒精灯，双手擦拭消毒，金属工具灭菌，做好实验准备。 实验前的准备工作 点着酒精灯，双手擦拭消毒，金属工具灭菌，做好实验准备。

1、点着酒精灯

2、双手擦拭消毒

3、剪刀灭菌 外焰 外焰

4、酒精中冷却

5、把酒精烧去

烟草无菌苗的快速切繁 1、打开长有无菌烟草苗的三角瓶，三角瓶瓶口使用前后需在酒精灯外焰上烧过灭菌。

6、打开三角瓶——铝箔纸的拿法

7、瓶口在火焰上烧过

8、铝箔纸的放法

烟草无菌苗的快速切繁 2、用灭菌的镊子轻轻捏出幼苗，放在无菌的培养皿中，用灭菌的剪刀将主茎剪成若干小段（0.5-1cm的） ，要求每段至少包含一个生长点。

9、镊出烟草苗

10、镊出烟草苗

11、放入培养皿中

12、烟草幼苗形态——生长点 叶腋

13、剪取茎段

14、剪好的烟草苗

培养皿的拿法

烟草无菌苗的快速切繁 3、接入盛有MS培养基的三角瓶中，每一个切段必须直接接触培养基，三角瓶口重新烧过灭菌，并重新封好。

15、烟草茎段接种

16、烟草茎段接种

17、接种好的烟草苗 注意生理性上端和下端不要倒置！

18、接种好的烟草苗

19、重新封好瓶口 轻烧锡箔纸内表面

20、重新封好瓶口 瓶口也要轻烧灭菌

21、重新封好瓶口

22、重新封好瓶口

23、写好班级和实验号

烟草无菌苗的快速切繁 3、在光照培养箱中，25℃，16小时光照条件下培养2周，可长成完整植株。

烟草快繁 光照培养

豌豆苗的茎尖培养 １、取豌豆幼苗10株，剪取1cm左右的茎尖→浸入70%的酒精1分钟→消毒液中15分钟→无菌水冲洗5次→移入灭过菌的装有滤纸的培养皿中。

1、豌豆幼苗形态

2、剪取豌豆茎尖 茎尖 茎尖

3、剪好的豌豆茎尖

4、倒入70%酒精处理1分钟

5、倒去酒精

6、倒入消毒液处理15分钟

7、倒去消毒液

8、无菌水冲洗5次

9、取出茎尖

10、在滤纸上吸干水分

　豌豆苗的茎尖培养 ２、在双目解剖镜下，用灭菌的解剖针剥去幼叶露出生长锥，挑取带着两至三个叶原基的生长锥。移到盛有Ms培养基的培育皿中，用封口膜将培养皿封好，诱导愈伤组织形成。

11、双目解剖镜下解剖豌豆茎尖 （每人解剖一个茎尖接种）

6、培养皿封口

　豌豆苗的茎尖培养 ３、在恒温培养箱中，26℃下,培养六周，可形成簇生芽丛。 

豌豆茎尖恒温培养

六、实验结果观察 1、两周后，观察烟草幼苗的成长情况。 2、五周后，观察豌豆愈伤芽丛的生长情况。 3、实验报告: 教材107页（空留，以后观察填写） 1 0 8 页（a，b，c，d四道思考题）

未受污染健康生长的烟草 受微生物污染的烟草

健康生长的豌豆愈伤芽丛

健康生长的豌豆愈伤 芽丛与受各种微生物 污染的豌豆茎尖培养物

4 、无菌器皿的使用 烟草苗的剪切 豌豆苗的消毒处理 豌豆茎尖解剖 豌豆茎尖吸水 烟草愈伤和豌豆茎尖接种

实验全程录像

感悟思考： 学科中的基础理论与新技术的产生 ●植物细胞的全能性……(基础理论) ●理论与实践技术的产生 实践技术中的瓶颈？如何突破 无菌、培养条件（温度、光照、培养基） ●产生了植物细胞组织培养技术 应用产生了的新技术 快速繁殖、茎尖脱毒、植物生物工程

石斛植物的芽培养

黄芪的发状根培养

植物生物工程反应器 新鲜培养基 黄芪发状根的液体培养 含有有用物质的培养基

联想：动物细胞培养 ●动物细胞是否有全能性 ●动物细胞培养的瓶颈问题 ●如果动物细胞培养技术成熟 ●我们能应用动物细胞培养做那些事情…… 器官培养与移植 生物工程制造生物药物 种子资源的保存 动物的遗传与育种 克隆个体…… 克隆人? ……

感悟思考： 学科中的基础理论与新技术的产生 ●植物细胞的全能性……(基础理论) ●理论与实践技术的产生 实践技术中的瓶颈？如何突破 无菌、培养条件（温度、光照、培养基） ●产生了植物细胞组织培养技术 应用产生了的新技术 快速繁殖、茎尖脱毒、植物生物工程

注意 实验结束后请在解剖镜登记本上做好记录； 将解剖镜放入实验桌下的柜子中。