PCR引物设计及测序结果分析

Content 聚合酶链式反应（PCR） 的技术原理及结果分析 PCR引物设计原理及相关软件的使用（ Primer Premier 5.0 ） 测序结果分析

一 . PCR的技术原理及结果分析 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为基因的体外扩增法。 PCR不仅可以用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分析，还可以用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病的诊断，肿瘤机制的探索，法医鉴定等诸多方面。

PCR技术原理 以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板5′末端和3′末端互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成，重复这一过程，即可使目的DNA片段得到扩增。 正义链 反义链

                                                                                                                                                                                      基本分子生物学研究手段 PCR PCR反应液体的成分: PCR循环的程序: PCR原理：

                                                                                                                                                                                      基本分子生物学研究手段 RT-PCR 反转录PCR mRNA---cDNA-----PCR

                                                                                                                                                                                      基本分子生物学研究手段 Cutting by enzymes

                                                                                                                                                                                      基本分子生物学研究手段 Southern Blot

                                                                                                                                                                                      基本分子生物学研究手段 Northern Blot

PCR技术的基本过程 循环仪 94oC 5’ TaqDNA聚合酶 94℃ 预变性 55 ℃ 72 ℃ 模板DNA dNTP 模板DNA 引物 Buffer 模板DNA dNTP 引物 Buffer 94℃ 55 ℃ 72 ℃ 循环仪 预变性 94oC 5’ PCR技术的基本过程

变性 退火 延伸 94˚C Tm 72˚C 从结合在特定DNA模板上的引物为出发点，按5’→3’的方向沿着模板顺序合成新的DNA链

扩增出目的条带之外的多条带（非特异性）？ 引物是否合适? PCR出现的问题： PCR扩增未得到目的条带？ 扩增出目的条带之外的多条带（非特异性）？ 扩增的目的条带很弱？ 引物设计是PCR 技术中至关重要的一环

PCR结果分析 PCR结果。1－2、PCR产物（3ul样品）

PCR常见问题 1. 无扩增产物 模板:含有抑制物，含量低 Buffer对样品不合适 引物设计不当或者发生降解 退火温度太高 现象：正对照有条带，而样品则无 对策: 1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量 2.更换Buffer或调整浓度 3.重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物 4.降低退火温度、延长延伸时间 

2. 非特异性扩增 引物特异性差 模板或引物浓度过高 酶量过多 退火温度偏低 循环次数过多 现象： 1）PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致； 2）或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。 对策： 1.重新设计引物或者使用巢式PCR 2.适当降低模板或引物浓度 3.适当减少酶量 4.降低镁离子浓度 5.适当提高退火温度或使用二阶段温度法 6.减少循环次数 

3. 拖尾 模板不纯或降解 Buffer不合适 退火温度偏低 酶量过多 dNTP、Mg2+浓度偏高 循环次数过多 M 1 2 产物在凝胶上呈Smear状态

4. 假阳性（筛选转基因、检测基因表达情况) 交叉污染 对策 操作时防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外； 除不能耐高温的物质外，所有试剂器材均高压消毒。离心管及枪头等一次性使用。 各种试剂先进行分装，低温贮存。 设置阳性和阴性对照，重复实验

PCR的应用 1、目的基因的克隆： PCR技术为在重组DNA过程中获得目的基 因片段提供了简便快速的方法。 2、基因的体外突变： 　　因片段提供了简便快速的方法。 2、基因的体外突变： 　　可以随意设计引物在体外对目的基因片段 　　进行嵌和、缺失、点突变等改造。

3、DNA和RNA的微量分析： 4、基因转录水平检测 5、基因突变分析： 　　PCR技术高度敏感，对模板ＤＮＡ的含量要求很低，是DNA和ＲNA微量分析的最好方法。实际工作中，一滴血液、一根毛发或一个细胞已足以满足PCR的检测需要，因此在基因诊断方面具有极广阔的应用前景。 4、基因转录水平检测 　　RT-PCR可检测不同组织或细胞中基因的转录水平. 5、基因突变分析： 　　　利用PCR与一些技术的结合可以大大提高基因突变检测的敏感性。

二. PCR引物设计原理及相关软件的使用（ Primer Premier 5.0 ） 引物的重要性 引物设计的原则 引物同源性分析 引物设计软件 如何使用Primer Premier 5.0 酶切位点及保护碱基的添加

引物（primers) 引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。(上游引物与DNA序列一致,下游引物要反相互补.) → Sense primer 3’ 5’ ← 5’ 3’ Antisense primer

引物的重要性 在整个PCR体系中, 引物占有十分重要的地位。PCR的特异性要求引物与靶DNA特异结合，不与其他非目的DNA结合，PCR的灵敏性要求DNA聚合酶能对引物进行有效的延伸，可见引物设计好坏与PCR结果密切相关。

引物设计原则 引物长度 碱基分布的均衡性 Tm值 引物二级结构 引物3’端 引物5’端 引物的内部稳定性 引物的保守性与特异性 扩增区域的二级结构

基本原则： 引物与模板的序列要紧密互补 引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构 引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。

具体因素： 引物长度（primer length） 产物长度（product length） 序列Tm 值(melting temperature) 形成引物二聚体(primer dimer)及发夹结构（duplex formation and hairpin）的能值 在错配位点（false priming site）的引发效率 引物及产物的GC含量（composition）

1. 引物的长度：配对引物的长度一般在15-30bp之间比较合适。 一般原则： 1. 引物的长度：配对引物的长度一般在15-30bp之间比较合适。 尽可能使用两条引物的Tm值相同（最好相差不要超过 5℃） Tm值的计算：一般的公式：Tm = 4 (G+C) + 2(A+T) 2. 引物的GC%含量：一般为40%-60%。上下游引物的GC含量不能相差太大。 引物过短又同时会引起错配现象，一般来说引物长度大于16bp是必要的（不容易引起错配）。 引物过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。 引物序列的GC 含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。 上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。 尽可能使用两条引物的Tm值相同（最好相差不要超过5℃），退火温度根据较低的Tm值选定，也可以通过改变引物的长度来平衡两条引物的退火温度。Tm值可 以根据Tm=4(G+C)+2(A+T)计算。而对于较长的引物，Tm值需要考虑动力学参数、从“最近邻位”的计算方式得到，现有的PCR引物设计软件大 多数都采用这种方式。（注：对于Tm值的计算有争议的地方是附加序列应不应该计算在内，我觉得有值得商讨的地方。因为从理论上只有最开始的循环引物的附加 序列是不与模板链结合的，而在后来的PCR反应中，引物的附加序列是和模板链结合了的。）

3. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。 3. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。 4. 引物3’端的末位碱基避开密码子的第3位，且最好不选择A 5. 引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。 引物3’端出现3 个以上的连续碱基，如GGG 或CCC，也会使错误引发机率增加。 引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。对Taq 酶的DNA 合成效率有较大的影响。末位碱基为A 的错配效率明显高于其他3 个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成 引物的5′ 端决定着PCR 产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′ 端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。

6. 引物无回文对称结构，否则会形成发夹结构；引物自身不能配对，否则易形成约两个引物长度的引物二聚体； 6. 引物无回文对称结构，否则会形成发夹结构；引物自身不能配对，否则易形成约两个引物长度的引物二聚体； 引物二聚体 发夹结构

7. 引物5’端可以有与模板DNA不配对碱基，在5’端引入一段非模板依赖性序列。 5’端加上限制性核酸内切酶位点序列（酶切位点5’端加上适当数量的保护碱基）。 5’端的某一位点修改某个碱基，人为地在产物中引入该位点的点突变以作研究。 5’端标记放射性元素或非放射性物质（如生物素、地高辛等）。

8. 引物的保守性与特异性 保守性：通用引物——检测同一类病原微生物尽可能多的型别 特异性：避免非特异性扩增

引物同源性分析 用Blastn软件进行同源性比较 尽可能选择与非目的基因同源性小的序列作为引物 选择3’端与非目的基因不同源的序列作为引物

引物设计软件 Primer Premier 5.0 Oligo primer 3 The Primer Generator 生物软件网下载 安装后，用文本编辑器打开WIN.INI，将vspace=DU改为vspace=PU便可以使用全部功能。 Oligo primer 3 The Primer Generator NetPrimer

如何使用Primer Premier 5.0 引物设计 探针设计 引物评析 一般引物设计 5’带酶切位点引物设计 巢式PCR引物设计

Primer Premier 5.0主要功能: 1、引物设计 2、限制性内切酶位点分析 3、DNA 基元(motif)查找 4、同源性分析

Primer Premier 5.0使用介绍 Load sequence Preimer Premier 启动界面

引物设计界面 Sequence name Original sequence Choose a function Use these two button to translate the DNA seq to a protein seq or a protein seq to a DNA seq 8种密码子偏好 http://www.yrbio.com

引物设计界面 First you can design the primer manually Sense strand or anti-sense strand Useful information of the primer

引物搜索选项设定 引物类型 搜索模式 引物长度 5’引物位置范围 3’引物位置范围 产物大小范围

搜索结果 28对引物 每对引物的信息 引物分值 100分为满分 双击选中一对引物

是否出现hairpin,dimer,false priming and cross dimer 回到主窗口 引物信息 引物及产物信息 是否出现hairpin,dimer,false priming and cross dimer

引物编辑

引物编辑 编辑引物 分析引物结果 确认编辑的引物

酶切位点及保护碱基的添加 基因克隆 质粒DNA 基因片段 重组DNA

酶切位点的查找

酶切位点的选择原则: DNA序列当中不含有该酶切位点. 载体中只在多克隆位点含有该酶切位点. 按照酶切位点在多克隆位点中的顺序分别将选用的酶切位点放在上下游引物中. 尽量选择粘性末端的酶切位点. 在有多种选择的情况下,选择便宜且酶切效果好的.

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保护碱基 酶切位点 引物序列

三. 测序结果分析 测序结果得送检. 测序结果的观察. 测序结果得比对.

好的测序结果

不能选用的测序结果

测序结果的比对

Thank You