大肠杆菌生长曲线的测定 水、环境中微生物的测定 大肠杆菌生长曲线的测定 水、环境中微生物的测定 裴国风 程国军

实验31 大肠杆菌生长曲线的测定 一、实验目的 了解光电比浊计数法的原理。 学习、掌握光电比浊计数的操作方法。 实验31 大肠杆菌生长曲线的测定 一、实验目的 了解光电比浊计数法的原理。 学习、掌握光电比浊计数的操作方法。 通过细菌数量的测量了解大肠杆菌的生物特征和规律，绘制生长曲线。

二、实验原理 生长曲线 一个典型的生长曲线分为延缓期、对数期、稳定期和衰亡期四个时期 将少量纯种单细胞微生物接种到定量的液体培养基中，定时取样测定细胞数量，以培养时间为横坐标，以菌数为纵坐标作图，得到一条反映单细胞微生物在整个培养期间菌数变化规律的曲线。 一个典型的生长曲线分为延缓期、对数期、稳定期和衰亡期四个时期

微生物数量的测定方法 稀释平板计数法 显微镜直接计数法 最大概率法 光电比浊法

稀释平板计数法 显微镜直接计数法 对样品稀释培养，据形成的菌落数计数。 优点：活菌计数方法，对设备要求不高。 缺点：操作复杂。 使用血球计数板在显微镜下直接计数。 优点：操作简便，计数直观。 缺点：计数结果为活细菌和死菌体的总和。

最大概率法 待测菌液经十倍系列稀释，每稀释度做3-5个重复，经培养后，检查细菌的生长，以有细菌生长的最后三个稀释度的管数作数量指标，由数理统计表查出近似值，再乘以数量指标第一位的稀释倍数，即为原菌液中的菌数。

最大概率法 优点：活菌计数，适用于特殊细菌。 缺点：计数结果为概值。 例如：某细菌在稀释培养法中生长情况如下： 稀释度： 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 重复数： 5 5 5 5 5 5 有菌生长管数： 5 5 5 4 1 0 根据上述结果，数量指标为“541”，查表得近似值为17，乘以第一位数的稀释倍数，得出原始培养物的活菌数=17×105个 优点：活菌计数，适用于特殊细菌。 缺点：计数结果为概值。

光电比浊法 光电比浊法是利用在一定的范围内，微生物细胞浓度与透光度成反比的原理。当细菌细胞在溶液中数量越多，浊度越大，在光电比色计中测定时所吸收的光线越多。 优点：简便快速，适合于自动控制。 缺点：测定结果受培养液成分影响；某些样品 样品不适合用此法。

三、实验器材 菌种 培养不同时段的大肠杆菌。 仪器或其他用具 分光光度计，比色皿等。

四、实验步骤 1.样品测试前的调试 开电源，仪器预热20 min，将波长调至600 nm处。 打开样品室，将挡光体插入比色皿架，将其推或拉入光路。 盖好样品室盖，在T MODE下，按0%T键调零透射比。 取出挡光体，按100%T/OA键调100%透射比。

2.样品测定 将参比溶液（未接种的LB液体培养基）以及被测溶液倒入比色皿中。 打开样品室盖，将参比溶液放在样品架的第一个槽位中，将被测溶液依次放入其它槽位。 将参比溶液推入光路，按100%T/OA键调满度。 按MODE，将测试方式调至吸光度方式（A）。此时,显示器显示“0.000”。 将被测溶液推入光路，显示器显示为被测样品的吸光值。

在600 nm波长下，用未接种的LB液体培养基作空白对照，分别对培养了0、4、8、12、16和20 h的大肠杆菌培养液，进行光电比浊测定。对于高浓度的大肠杆菌培养液,要用未接种的LB培养基进行稀释，使其吸光值在0.1-0.65范围内。 比色皿经蒸馏水清洗后，必须经待测样品润洗。比色皿的毛面用吸水纸擦干，而光面只能用吸水纸吸干，以免光面被划破。 比色皿之间吸光度进行比较。

四、实验结果 记录不同大肠杆菌培养液的OD600值，并绘制大肠杆菌的生长曲线。 4 8 12 16 20 24 培养时间（h）

五、思考题 光电比浊计数的原理是什么？这种计数法有何优缺点？ 如果用活菌计数法制作生长曲线，你认为会有什么不同？两者各有什么优缺点？

实验67 水、环境中微生物的测定 一、实验目的 比较不同场所和不同条件下细菌的数量和类型。 观察不同类群微生物的菌落形态特征。 实验67 水、环境中微生物的测定 一、实验目的 比较不同场所和不同条件下细菌的数量和类型。 观察不同类群微生物的菌落形态特征。 体会无菌操作的重要性。 掌握水和环境中微生物的测定方法。 检测污染水域微生物的类型和数量。

二、实验原理 应用平板菌落计数技术测定污染水的细菌总数。由于细菌种类繁多，不可能找到一种培养基在一种条件下，使所有的细菌均能生长繁殖。因此，计算出来的细菌总数仅是一种近似值。 利用普通牛肉膏蛋白胨琼脂培养基可以大 致测定不同环境中存在的微生物。

三、实验器材 样品的采取 培养基 仪器或其他用具 自来水 取自自来水管道。 橙汁 购于超市。 口腔、人民币、门把手和实验环境中的微生物。 自来水 取自自来水管道。 橙汁 购于超市。 口腔、人民币、门把手和实验环境中的微生物。 南湖水 距水面10-15 cm的深层水样。 培养基 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基 。 仪器或其他用具 灭菌培养皿，无菌枪头，涂棒等。

四、实验步骤 1.南湖水中微生物的测定 无菌操作采用10-1， 10-2 ， 10-3稀释液涂布牛肉膏蛋白胨平板;每个稀释度2个重复。 N-乙酰葡糖胺 无菌操作采用10-1， 10-2 ， 10-3稀释液涂布牛肉膏蛋白胨平板;每个稀释度2个重复。 每个培养皿加0.1ml 稀释液

2.口腔、人民币和门把手微生物的测定 3.实验室空气中微生物的测定 4.自来水、橙汁中微生物的测定 用棉签分别从牙周、人民币纸币和门把手表面挑取微生物，然后放入装有0.5 ml无菌水的EP管中，颠倒均匀后，用移液器全部吸入牛肉膏蛋白胨平板中，涂布均匀。 (LTA) 3.实验室空气中微生物的测定 将牛肉膏蛋白胨平板盖揭开，分别置实验台10，20，30，40，50，60 min后，盖上皿盖，倒置培养。 4.自来水、橙汁中微生物的测定 取1 ml涂布牛肉膏蛋白胨平板。自来水用无菌三角瓶收集。

四、实验结果 观测实验结果时间？ 计算每ml南湖水中含有微生物的数量。 你所测定的环境中微生物的数量和种类；并试着分别记录每种细菌的大小、形态、干湿、透明度、颜色以及边缘等特征。 名 称 南 湖 水 自来水（个/mL） 口 腔（个/cm2 人民币（个/cm2） 门把手（个/cm2） 空 气（分钟） （个） 10-1 10-2 10-3 总数 数 量 形 态

五、思考题 你所测定的南湖水的污染程度如何？ 通过本次实验，在防止培养物的污染与防止细菌的扩散方面，你学到了什么？有什么体会？

本次实验安排 每组6人 比浊法测定大肠杆菌生长曲线。 倒牛肉膏蛋白胨平板12个。 南湖水稀释分离涂布(6皿)。 口腔、人民币、门把手、空气（10，20，30，40，50，60 min）、自来水和橙汁微生物的测定。（1种/人）

本次实验完