五指山猪种质特性 及开发利用研究 冯书堂 牟玉莲 张莉 等 中国农业科学院畜牧研究所 10094 北京

目录 序 言 一、WZSP实验化培育研究 二、生长发育规律、矮小型遗传机理研究 三、WZSP近交系种质特异性研究 七、建立中国实验用小型猪资源开发与研究应用中心

序 言 五指山猪（WZSP）产地与特征： 处于濒灭境地 60年代存拦10万头， 70年代600余头， 1987年发现纯种猪10余头； 中国农科院畜牧所异地保种（同窝1母、1公）； WZSP究竟有何保种价值？ WZSP种质特性的多方位、深层次多方面的研究；

研究新发现： 生理解剖、血液生化指标、 器官生长发育、 营养、药物代谢、 SLA基因分型近似人类； 基因高度纯合、MHSn基因频率为零； 生长激素基因和受体基因等具有特异性； SW936 88bp为其特有等位基因； 近交系的培育初步成功、应用展示出的诱人前景。

一、实验动物化培育 1、近交繁育 采用全同胞交配、父女交配和祖孙三世代内交配繁育，目前F14种猪存栏40余头、F1538头，F1624头，F17种猪11头，已产出F18后代。并建立了WZSP实验用近交系谱等。 结果表明： WZSP近交繁育已跨越近交衰退及大批死亡的危险阶段，目前已近交繁育出第18代。我国WZSP近交系的研究水平已领先国外至少十年，已成为国内外专家共识的、世界的一流产品。

2、近交繁育规律研究 通过500余头次数据分析结果表明 近交对WZSP繁殖力影响较大: F4仔猪成活率极低（19.05% 2/12 ），F10仔猪成活率较低（35.39% ,6/27 ），近交代数增加仔猪成活率逐渐提高（F16 62.50 %、10/16、F1763.60 % ）; 死胎、木乃伊比例逐渐降低(F4为8.33 %，1/12, F17为 0% ，0/11)； F13以上青年母猪第一次妊娠时间由原来的5～6月龄推迟到7～8月龄；初步发现随近交代数增加体重减轻趋势明显； 据资料统计WZSP近交后代300余头未出现毛色分离现象（1996）。其毛色特征表明，经过F10近交后其毛色基因已达到一定程度的纯合。

3、近交佐证、微卫星 DNA标记监测 群体遗传结构研究

表1 F14、F15、F16三个世代9个微卫星基因座的杂合度和多态信息含量 (未分家系之前) 表1结果证实：9个微卫星基因座杂合度和多态信息含量在F14、F15、F16三个世代分别 呈现递减，即： H14≥H15≥H16和 PIC14≥PIC15≥PIC16。随着近交世代的递增，群体的遗传变异性 逐步降低。

表2 3个家系在9个微卫星基因座上的杂合度和多态信息含量 表2 3个家系在9个微卫星基因座上的杂合度和多态信息含量 家系名称 世代 杂合度 多态信息含量 备 注 20-22（Ⅱ） F15 0. 2075  0.1588 5个基因座纯合； 已获F16个体。 26（Ⅰ） 0.2934 0. 2227 3个基因座纯合； 已获的F17个体。 32（Ⅲ） 0.3005 0.2408 2个基因座纯合； 由表2可知，WZSP在9个微卫星位点的平均等位基因数2.11个，3个家系杂合度和多态信息含量分别为0.2934和0.2227、 0.3005和0.2408 、 0.2075和0.1588 ；随着群体家系的建立，各家系间微卫星位点的平均等位基因数虽有所不同，但其杂合度和多态信息含量降低、基因纯合度有所提高

利用36对微卫星DNA标记监测群体遗传结构研究 利用36个探针对WZSP近交系F14、F15进行遗传基因纯和度及同质化进行研究。结果每一个探针多数可得到1,2,3条图带、少数可得到6条图带，证实：WZSP近交繁育的可靠性、遗传的稳定性。

WZSP与其它近交品系猪DNA指纹图相似系数与近交系数的关系 （李幼平编著-移植免疫生物学-1999年科学出版社） 证实：WZSP F8群体DNA指纹图相似系数（0.86）等同于西双版纳小型猪F12（0.86）；WZSP世代DNA指纹图相似系数的轨迹符合近交小鼠的曲线图。这一结果将WZSP实验用近交系种猪实际的近交繁育向前推进了4个世代，并为WZSP实验用近交系的建立，提供了坚实的理论基础和科学依据。

二、生长发育规律、矮小型分子遗传机理研究 1、经过数百次测定和分析证实：WZSP具有体型小、性成熟早、6月龄体重15～20kg，24月龄体重35～40kg，较之国内、外其它小型猪具有体重轻、个体小的优势。依据F12、F13、F16的初生重至6月龄、500头次体增重记录，进行指数曲线、logistic曲线、compertz曲线分析，求出其三个曲线生长公式模式。 拟合公式：W=4594.15e0.0063t； 拟合度： 0.7782 依据WZSP生长曲线拟合公式和拟合度可较准确的估测WZSP实验用近交系体重，使之向实验动物化推进了一大步，为进一步各类动物模型培育、人源化猪器官移植开发应用，提供了一定的科学依据。

2、矮小性和遗传稳定性是实验动物必须具备的两大要素 但WZSP近交系能否真正最终被确立为理想的实验用猪，关键在于是否具有矮小型基因特征？ 结果发现： WZSP的GH基因非编码区多处发生碱基替换或缺失 编码区发生了三个碱基替换并都导致编码的氨基酸 残基改变，两个发生在高度保守区内，这可能影响 到成熟GH的空间结构，进而影响其活性（14）， 成为五指山猪矮小的可能原因之一。 证实GH受体基因与正常猪也有较大的差异（7）。 WZSP近交系属于侏儒动物一类。

三、WZSP近交系种质特异性研究 WZSP近交系50多项血液生理、生化指标近似人类；无 MHSn基因； 近交繁育对其肝脏、肾脏等药物代谢、生化合成反应等与人类代谢未发现不匹配现象； 依据人的血液分型方法，对WZSP实验用近交系F10、F16进行分型研究，显示WZSP血型均为o型(20/2次)；

WZSP肉质细嫩、香味浓。异地饲养仍能保持香味，而其它小型猪，如香猪异地饲养失去原产地香味浓的特色。研究还发现WZSP肉质中的喹啉酸, 丙二酸乙基戊基酯含量，分别显著高于市场肉8和20倍；WZSP肉质中含有丰富的各种氨基酸,含量高达72.615%, 并含有三种人体必需氨基酸等。

四、特有的遗传标记研究 特有的遗传标记是作为实验动物必不可缺少的条件之一 1、通过两批、428头9个品种猪、18个微卫星探针的研究，发现微卫星座位Sw936在WZSP近交系中具有特异性等位基因。 2、WZSP近交系群体微卫星座位Sw936 特有等位基因检测研究发现： Sw936含特有的等位基因比例为70.9%( 77/110) ； 克隆、测序结果为88bp,（姜盛花, 85bp）； GenBank公布的微卫星座位Sw936的序列长度范围为92-112bp； WZSP近交系相应少11个重复单位； 微卫星座位Sw936的一个新等位基因。

SSCP and sequencing results showed that no poly 五、WZSP分子遗传基础研究 完成了经典的SLAⅠ类及Ⅱ类基因（包括P1,P14,P7,DRA,DRB,DQA,DQB）在WZSP群体SLAⅠ类及Ⅱ类分别为22头和60头）中的SNPs分析，并采用AS-PCR 技术对存在多态的DQA,DRB和DQA、DQB基因进行分型等。 1、SLAⅡ基因型研究发现：DRA在WZSP群体中没有发现多态，DRB具有多态性，并对DRB测序进行了分析；DQB在WZSP实验用近交系群体中没有多态性，DQA具有多态性，并对DQA测序进行了分析。 2、SLA1与HLAⅠ类基因多态结合区的比较分析结果显示：SLA1 与HLAⅠ类基因多态结合区氨基酸序列存在50-55%的同源性，而SLAⅠ类基因之间在多态结合区存在75%左右的同源性。 SSCP and sequencing results showed that no poly -morphism in DQB locus of the inbred strain WZSP.

3、SLA与NIH及人的比较 （1）WZSP近交系猪种经典SLA-I和II基因及其氨基酸序列，与NIH小型猪比较发现DRA为高度保守序列，无多态性、核苷酸水平和氨基酸水平同源性均为100%；而对于其它具有多态性的基因，核苷酸水平同源性90%以上，氨基酸水平同源性达87%以上； （2）DQA、DRA相应基因的氨基酸序列与中国南方人群同源性达73%至83.7%左右； （3）从基因多态性WZSP近交系SLA基因和HLA基因进行分析比较，该品系与我国南方人群基因位点氨基酸序列同源性为77% -80%左右； 初步证明： WZSP近交系为人类理想的实验用动物模型，必要的修饰和改造后、做为异种器移植供体是可能的。

六、开发利用研究 目前已同国内30多个科研院所、先后将上千头猪用于药学、胚胎学、畜牧兽医学、比较医学和人类异种器官移植等诸多试验和应用研究，如： 1、异种器官移植比较医学研究（北京友谊医院、解放军309医院、北京佑安医院）； 2、人异种器官移植比较医学研究（四川大学医学院等）； 3、WZSP 应用于异种动物器官眼睫膜、胰腺细胞移植（同仁医院）； 4、国家一类新药毒性安检（中国医药开发中心、军事医学科学院、解放军301医院）； 5、心血管血流图及冠状动脉硬化模拟试验（北京中医科大学东直门附属医院）； 6、心血管疾病模型(北京友谊医院、北京阜外医院、中医医科大学东直门医院) 7、WZSP 在人类烧伤、植皮上的研究应用(解放军304医院)； 8、WZSP 在人类去脂减肥技术上的动物模型试验(中国医科院外科整形医院)；

9、人类口腔疾病上的模型研究(北京口腔医科大学、天坛医院口腔研究所、武警总医院)； 10、猪胚胎干细胞和原生殖细胞研究（北京大学、中科院上海细胞所－姚鑫院士课题组）； 11、器官移植中免疫学-白细胞抗原学研究（武汉同济医科大、器官移植研究所、南京农大等）； 12、猪瘟病毒、细菌等敏感性研究(中国兽药监察所、军事医学科学院等)； 13、肉质风味特性研究 (北京市微量研究所、中国农大食品学院) 。

研究成果（专利2项）

七、建立中国实验用小型猪资源开发与研究应用中心 随着WZSP等品系小型猪的深入研究和广泛应用，已成为我国畜牧科学研究的新亮点之一。引起国际同行专家的关注，更引起我国政府科技部、农业部等领导的重视，将WZSP列为建立国家WZSP保种场、社会公益型项目、国家“十五”科技攻关项目。 目前，对300余头WZSP、贵州香猪和广西巴马等品系小型猪，分别采血、分离血清，检测了猪蓝耳病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒、口蹄疫病毒、猪流感病毒、戊型肝炎病毒、日本乙型脑炎病毒、衣原体、弓形体、布氏杆菌、萎缩性鼻炎、猪喘气病等13中病原的抗体，为随后开展剖腹净化工作、培育出符合国际标准的、具有我国特色的SPF化实验用小型猪奠定基础。

产业化前景 为我国比较医学研究、异种器官移植等替代产品研究和应用提供合格的实验动物； 培育SPF猪生物反应器，以适应人类输血等组织工程的需要； 研制SPF人源化基因猪，解决我国人类器官移植供体（如心脏、肾脏等）不足的问题；用于肉猪杂交改良等。 总之，我国WZSP近交系等小型猪可创世界一流产品，可立竿见影地对国家的生物医学平台和农业生物技术平台提供支撑，抢占这一新的动物基因资源和相关产业的制高点，把握这个战略机遇将会实现巨大的经济价值。

谢 谢 欢迎各位批评指正 *该项研究由农业部：八五（85-牧-07-03）、九五（95-牧-02-08-03）、农计函(2003)No.30等 国家自然科学基金委：（No.39830190、No.339993420） 科技部：No.2001DIA400036 、No.2003DEB6j078、 No.2004BA717B 等项目共同资助。