真菌学及检验

目的与要求 1、掌握真菌的概念 2、掌握真菌的生物学性状。 3、了解真菌的致病性与免疫性。 4、掌握真菌的常规检查法。

真菌的基本性状

真菌（Fungus）概念: 是一类有典型的细胞核和完整细胞器，不含叶绿素，不分根、茎、叶的真核细胞型微生物。 细胞结构完整。

Fungus 特点 具有典型细胞结构（细胞核、细胞器、细胞壁） 细胞壁含几丁质和（或）纤维素 无根、茎、叶，不含叶绿素 以腐生或寄生方式摄取养料 能进行有性生殖和（或）无性繁殖

第一节 真菌的生物学地位与分类 生物学地位：真菌界 分类： 真 菌 界 粘菌门 (Myxomycota) 接合菌亚门 子囊菌亚门 担子菌亚门 第一节 真菌的生物学地位与分类 生物学地位：真菌界 分类： 粘菌门 (Myxomycota) 真 菌 界 接合菌亚门 子囊菌亚门 担子菌亚门 半知菌亚门 真菌门 (Eumycota)

对人类致病的真菌分为： 浅部真菌：侵犯皮肤、毛发、指甲，为慢性， 对治疗有顽固性，但影响身体较小 深部真菌：可侵犯全身内脏，严重的可引 起死亡。 　　此外有些真菌寄生于粮食、饲料、食品中 ，能产生毒素引起中毒性真菌病。

第二节 真菌的生物学性状 一、形态与结构 二、培养与繁殖 三、变异性与抵抗力

一、真菌的形态与结构 结构：比细菌复杂 大小：比细菌大几倍～几十倍 细胞壁缺乏肽聚糖，为几丁质(Chitin)（多聚N－乙酰葡萄糖组成），并含葡聚糖，甘露聚糖及蛋白质，某些酵母菌还含类脂体。 细胞内有较为典型的核结构和细胞器。

真 菌 单细胞真菌 多细胞真菌 菌丝 孢子 （如：酵母菌、类酵母菌） 据功能分 据是否有隔分 据形状分 (hypha) (spore) 叶状孢子 分生孢子 孢子囊孢子 无性孢子 有性孢子 （霉菌Mold ） 许多病原性真菌因生活的环境如营养、温度氧气等的改变，孢子与菌丝两种形态可以互变，这类真菌称为二相性真菌。

真菌孢子和细菌芽胞的区别 真菌孢子 细菌芽胞 抵抗力 不强，60-70短时间杀死 强，煮沸短时间不死 数目 一条菌丝可产生多个孢子 一个细菌体只形成一个芽孢 作用 为繁殖方式之一 不是繁殖方式 形成位置 可在细胞内外形成 只在细菌细胞内形成 形状 形态、色泽多样 圆形或椭圆形

二、真菌的培养 培养特性： 营养要求不高，在 沙 保（Sabouraud）培养基上， PH4～6生长良好。 浅部真菌： 22～28℃，生长缓慢，大多于1～2 周出现典型菌落。 深部感染真菌：37℃长的最好，生长较快，3～4 天即长出菌落。

1．酵母型菌落 为单细胞真菌的菌落，形态与一般细菌菌落相似，以出芽形式繁殖，如新型隐球菌。 2．类酵母型菌落 外观似酵母菌落，但可见伸入培养基中的假菌丝，它是由伸长的芽生孢子形成，如白色念珠菌。 3 .丝状菌落 为多细胞真菌的菌落，由许多菌丝体组成。丝状菌落呈棉絮状、绒球状、粉末状或石膏粉样，在下面和背面可显示不同颜色，这些以及菌丝、孢子的形状都是真菌的鉴别依据。

三、变异性与抵抗力 易变异：经多次传代或培养时间过久，其形态、菌落性状、色素及毒力等都可以发生改变。用不同的培养基和不同温度培养，其性状也可不同。

抵抗力 真菌对干燥、阳光、紫外线及一般化学消毒剂抵抗力较强；对热敏感，一般60℃1小时可杀死真菌菌丝和孢子。对2.5%碘酒，10%福尔马林都敏感，一般可用福尔马林薰蒸被真菌感染的房间。对抗细菌的抗生素不敏感；灰黄霉素、制霉菌素、二性霉素 克霉唑等对其有抑制作用。

第三节 真菌的致病性与免疫性 一、致病性 （一）病原性真菌感染 （二）条件致病性真菌感染 （三）真菌超敏反应性疾病 （四）真菌性中毒 第三节 真菌的致病性与免疫性 一、致病性 （一）病原性真菌感染 （二）条件致病性真菌感染 （三）真菌超敏反应性疾病 （四）真菌性中毒 （五）真菌与肿瘤

　　1.病原性真菌感染：主要是外源性感染，浅部真菌：有亲嗜表皮角质特性，侵犯皮肤、指甲及须发等组织，顽强繁殖，发生机械刺激损害，同时产生酶及酸等代谢产物，引起炎症反应和细胞病变。 深部真菌：可侵犯皮下，内脏及脑膜等处，引起慢性肉芽肿及坏死。　　　 2.条件致病性真菌感染 主要是内源性感染（如白色念珠菌），此类感染与机体抵抗力，免疫力降低及菌落失调有关，常发生于长期应用抗生素、激素、免疫抑制剂、化疗和放疗的患者。

　3．真菌变态反应性疾病 由真菌性过敏原（如孢子抗原）引起过敏症，如哮喘，变态反应性肺泡炎和癣菌疹等。 4．真菌毒素中毒症： 侵犯害肝、肾、脑、中枢神经系统及造血组织。如黄曲霉毒素、某些镰刀菌素和黑葡萄穗素。 5、真菌毒素与肿瘤 如：黄曲霉素诱发肝癌。

2．特异性免疫：真菌感染中细胞免疫是机体排菌杀菌及复原的关键。 二、免疫性　 1．非特异性免疫：人类对真菌感染有天然免疫力。皮肤分泌短链脂肪酸和乳酸、血液中转铁蛋白、中性粒细胞和单核巨噬细胞的吞噬作用，以及正常菌群的拮抗作用。 2．特异性免疫：真菌感染中细胞免疫是机体排菌杀菌及复原的关键。 由于皮肤癣真菌与腐生性真菌间有共同抗原，因此一般不做血清学检查Ab辅助诊断此类真菌感染。

第四节　真菌的常规检验法 实验室检查： 标本采集 分离培养 直接镜检 生化反应 染色镜检 免疫学试验 以直接镜检和分离培养最重要。

一、临床标本的采集 1．皮肤的角质性物质：毛发、指(趾)甲、皮 屑等。 2．各种分泌物和排泄物：生殖道分泌物、耳 垢、痰、粪便、尿液等。 3．血液和体液：体液包括胸水、腹水、脑脊 液、淋巴穿刺液等。 4．脓汁及渗出物。

采集标本注意事项 1.采集的标本要适宜 不同真菌感染 应采取不同的临床标本。浅部真菌感染如体癣，应刮取病变边缘的痂、皮屑，发癣应取病发。深部真菌感染应取血液、脑脊液、脓汁等。 2.在用药前采集标本 一般真菌标本须在用药前采集，对已用药者则需停药一段时间后再采集标本。

3.采集的标本量要足 血液和脑脊液标本5ml，胸腔液20ml，皮屑标本两块，活体组织两份 (一份送病理科检查，一份作镜检和培养)。 4. 严格无菌操作 并进行消毒处理，尤其是采集血液和脑脊液标本，要避免污染杂菌。 5. 采集标本立即送检 深部真菌标本最长不得超过2h。

二、检验程序

三、检验方法 （一）标本直接检查 不染色标本检查 染色标本检查 （二）培养检查 （三）鉴定

（一）标本直接检查 1. 不染色标本的直接镜检： 1）标本制备： 2）检查方法： 3）封固液： 直接采取标本制片、显微镜下直接观察，若发现真菌菌丝或孢子存在时，即可初步判定为真菌感染。 1）标本制备： 2）检查方法： 3）封固液：

①KOH溶液： ②墨汁： ③水合氯醛－石炭酸－乳酸封固液： ④生理盐水： 本液适于检查致密的难以透明的材料（如毛发、指甲、鳞屑等）。 主要用于检查有荚膜的真菌（如新型隐球菌等） ③水合氯醛－石炭酸－乳酸封固液： 此液透明力较强，只限于不透明的标本。 ④生理盐水： 为观察真菌的出芽现象可用生理盐水代替氢氧化钾溶液。

直接镜检的意义 直接镜检的局限性： ①有诊断意义，如浅部真菌病等； ②通过真菌的形态，可确定某些致病性真菌的属或种, 如假丝酵母菌的厚膜孢子等； 直接镜检的局限性： ①阴性结果不能排除真菌感染； ②有假阳性结果。 因此，对直接镜检可疑结果应作复查或用其他检验方法鉴定。

2.染色标本检查 （1）革兰染色：各种真菌均染成革兰阳性。 （2）乳酸酚棉蓝染色 （3）糖原染色： 又称过碘Schiff（简称PAS或PASH）。真菌细胞壁由纤维素和几丁质组成，含有多糖。过碘酸使糖氧化成醛，再与品红－亚硫酸结合，成为红色，故菌体均染成红色。为真菌染色最常用的方法之一。

（4）嗜银染色（GMS）：染成黑色。 （5）粘蛋白卡红染色法（MCS）： 主要用于新生隐球菌荚膜的染色。隐球菌荚膜和细胞壁呈红色，细胞核呈黑色。 （6）荧光染色： 主要使用吖啶橙和氢氧化钾来染直接涂片、培养涂片及组织切片。

（二）培养检查法 1、培养基 常用真菌培养基及用途 培 养 基 用 途 沙保培养基 真菌的常规培养 放线菌酮－氯霉素琼脂 同上 　用 途 　沙保培养基　　　　　　 真菌的常规培养 放线菌酮－氯霉素琼脂　　 同上 玉米粉聚山梨酯－80琼脂 观察白假丝酵母菌的厚膜孢子 马铃薯葡萄糖琼脂　 观察真菌菌落色素，用于鉴别 尿素琼脂　　　　　　　　 用生化反应鉴别真菌 （红色癣菌和石膏样癣菌） 心脑浸液葡萄糖血琼脂　　 深部真菌培养（二相性真菌）

（2）试管培养：多用于菌种传代接种与保存。 （3）大培养：用平皿或培养瓶培养。 （4）小培养 可观察结构特征及发育的全过程。 2、培养方法 接种工具为接种钩、接种针和接种环 （1）直接培养 （2）试管培养：多用于菌种传代接种与保存。 （3）大培养：用平皿或培养瓶培养。 （4）小培养 可观察结构特征及发育的全过程。 1） 玻片培养 2）郭可大钢圈小培养法： 材料：培养基、钢环（用铁环或废电线之铝丝制成）、载玻片、盖玻片、毛细管、石蜡等。

先将无菌钢圈以热石蜡固定在玻片和盖玻片之间，钢环开口处深入底部加入培养基。加够半环即可凝固。用接种针取少量材料，接种在培养基表面。 　　 将接种好的玻片，放在平皿内，并放湿纱布以防干燥。逐日镜 检，一般约7ｄ即可长好。根据菌丝和孢子的结构特点进行真菌类别的鉴定。 真菌培养是目前鉴定真菌的唯一方法。培养真菌的温度为28℃，但深部真菌为37℃。菌落是鉴别真菌的方法。

（三）真菌的鉴定 方法： 1、生化反应 2、芽管形成 3、厚膜孢子生成 4、免疫学及分子生物学试验等。

1.真菌的生化反应 用于主要深部感染真菌如假丝酵母菌、隐球菌等。 1）糖(醇)类发酵试验 37℃，观察糖发酵情况。 2）同化碳源试验 含菌生理盐水与已融化的固体同化碳源培养基(45℃)混合，然后在培养基上分别加糖，置25℃孵育观察结果。若24h后无变化可重复加糖。如能同化则在糖周围有生长圈，否则无生长。一般对双糖发酵的真菌能同化或利用糖类或碳源。主要用于酵母菌的鉴定。

5）尿素分解试验 石膏样癣菌、新生隐球菌等可分解尿素。 3）同化氮源试验 同化碳源试验相同，但 需用无氮源的培养基，不要加糖类，而加入硝酸钾。用于观察酵母菌对硝酸钾的利用情况。 4）明胶液化试验：某些真菌可液化明胶。 5）尿素分解试验 石膏样癣菌、新生隐球菌等可分解尿素。 6）测定淀粉样化合物：某些真菌可产生淀粉样化合物，遇碘后变成兰色。 7）牛乳分解试验；真菌可使牛乳酸化、凝固、胨化、碱化等

2.核酸检测 医学真菌的鉴定手段引入了分子生物学的鉴定方法，从核酸碱基G+Cmol％分析、限制性片段长度多态性(RFLP)Southern印迹分析到脉冲场凝胶电泳(PFGE)PCR指纹、随机扩增多态性DNA(RAPD)以及DNA特殊片段测序等。

单细胞真菌 （酵母菌） 多细胞真菌

真菌菌丝的形态

1叶状孢子 真 菌 无 性 孢 子 形 态 芽生孢子 厚膜孢子 关节孢子 2分生孢子 小分生孢子 大分生孢子

芽生孢子

Candida albicans -- chlamydospore formation on cornmeal agar假丝酵母菌 厚膜孢子

3、孢子囊孢子

孢子囊孢子

真菌的有性孢子 （根霉菌的接合孢子）

假丝酵母菌菌落

青 霉 菌

石膏样癣菌

新 型 隐 球 菌

嗜银染色（GMS）