分子生物學實驗 part 1 presentation 生態班 第8組 組員: 932503 王盈心 932524 范祐誠 932536 鄭元誠
Cloning of a specific fragment into an expression vector
Cloning of a specific fragment into an expression vector
Amplifying the specific fragment by PCR Materials Negative Postitive ddH2O 6.3 µL 9 µL Taq polymerase buffer 2.0 µL dNTPs 1.0 µL PCR primers (F) 3.5 µL (R) Plasmid template 2.7 µL 0 µL Taq polymerase
Fragment size check by agarose gel electrophoresis 左圖中M為maker，最亮的band為3.0kbp，次亮的band為1.0kbp，最下方的band為5.0kbp 8-1為negative(不加DNA)，8-2、8-3為positive。 Positive跑出來的兩條band為708bp Band偏離正確的位置是因為跑膠時膠歪掉 所以我們跑出來的結果是正確的
Prepare of competent cells E. coli strain DH5α 加入300µl glycerol -70 ℃保存 OD600=0.4-0.6 100mM 150µl 放在冰上5min 42 ℃處理 2min
TA cloning of PCR product into pCR2 TA cloning of PCR product into pCR2.1-TOPO vector, transformation and screening of positive clones 使用的質體是一段直線型的DNA，兩端的3‘端多了一個T，利用taq他們會在PCR產物末端上加上A的特性，與plasmid末端的T經topoisomerase作用接合成環形DNA A topoisomerase Sticky end 為3‘ 多攜帶一個T
Prepare of competent cells E. coli strain DH5α 加入300µl glycerol -70 ℃保存 OD600=0.4-0.6 100mM 150µl 放在冰上5min 42 ℃處理 2min
Screening of positive clones Origin in replication(複製起始點) 抗抗生素基因 Multiple cloning site (MCS) Indicator (lacZ gene) Negative pCR 2.1-TOPO Map Positive
Screening of positive clones 正確藍白篩選的結果 我們的結果 Negative及positive全為白菌，且colony的數量不在可信任範圍(30-300個) 造成這樣結果的推論: 1.抗生素沒有作用 2.有污染
Mini-preparation of selected clones and restriction digestion diagnosis Solution I: breaking cell Solution II: DNA denature Solution III: DNA renature 取上清液，加入phenol/chloroform (400µl ) 離心後取水層(top) (300µl ) 加入NaOAC(30µl)，100%EtOH(750µl) 4℃離心後加入500µI 70%ethanol washing 離心 EcoRI Elution Buffe (ddH20 、RNaseA) HindIII 不加酵素處理
Restriction digestion diagnosis 由8-1可看出band的大小約為3.9kb，所以可看出8-1是blue colony 8-2.8-3 band 為white colony White colony: EcoRI皆理論上有4個切點(vector、PCR產物各兩個切點)，切出片段大小各是3.9kb、500bp和兩條100bp HindIII只有一個切點 Blue colony: EcoRI有2個切點； HindIII一個切點 8-1 是blue colony M是maker 8-2. 8-3為white colony N-不加入任何酵素處理的sample (環型DNA) E-加入EcoRI酵素處理的sample H-加入HindIII酵素處理的sample
Restriction digestion diagnosis White colony: EcoRI皆理論上有4個切點，但我們只有切出兩條band，因為沒有100bp可參考的maker，推測下方band約為500bp，100bp的band可能已經跳海 HindIII只有一個切點，切出來的片段比EcoRI的片段大，所以位置比較上面 Blue colony: EcoRI有2個切點，因為距離太接近切出來的片段很小，已經跳海，觀察不到；而切出來的band與HindIII大小差不多 因為maker沒有跑很開，所以band跑出來的位置只能做參考
資料來源: 1.Brown, T. A. 2001. Gene Cloning and DNA analysis. 4th edition. Stanley Thomes Published. UK. 2.http://www.mtsu.edu/~rseipelt/web4460c/id100.htm