细胞分离和细胞培养 细胞生物学 张惠丹 细胞生物学 张惠丹

1.细胞分离（ cell separation） (1) 制备单一细胞悬液 组织 EDTA 细胞间连接 消化 胰酶 细胞外基质 多细胞悬液

(2) 分离不同类型细胞 A. 离心 （centrifugation） 大小 密度 形状 小 轻 不规则 大 重 圆形

① B. 细胞的黏附性 C. 亲和性表面 ② 轻微震荡 消化基质

D. 流式细胞仪(flowcytometer,FCM) 荧光激活细胞分选仪（FACS） 原理： 用带有荧光的特异抗体标记待分离的细胞，然后在流式细胞仪中选出标记细胞。

应用： 细胞分选: 1cell in 1000 5000 cells/sec

E. 激光捕捉显微切割技术 (Laser capture microdissection,LCM) 原理： 应用：从组织切片中获取单一细胞

2. 细胞培养 （Cell culture） 从活体组织分离出特定细胞,在一定 的条件下进行培养,使之能够继续生 存、生长以至增殖的一种方法。 in vivo：用动物做实验 in vitro：用培养细胞做实验

(1) 细胞培养的条件 A .固体表面 B .培养基、血清 C .无菌、抗生素 D. 37℃、5％CO2 、95～100％湿度

(2)细胞培养的不同阶段 原代培养(primary culture) 传代培养(secondary culture) 成功 细胞系（Cell line） 筛选 细胞株（cell strain）

原代培养(primary culture):直接从生物体获取细胞进行培养。 传代培养(secondary culture)：将原代培养的细胞连续以一定 比例扩大培养。 细胞系(cell line) ：原代培养细胞成功传代即为细胞系。 细胞株（cell strain） ：从培养细胞中筛选出的具有特定性 质或标志的细胞群。

培养细胞的特点： 　　功能：保持原分化特性 　　形态：多不保持原有细胞形态 　　 成纤维样细胞 　　上皮样细胞

细胞系（NIH3T3: 1963年由小鼠成纤维细胞建立） 细胞系的来源： （１）变异细胞 　　可无限增殖、传代 　　细胞系（NIH3T3: 1963年由小鼠成纤维细胞建立） 　接触抑制:细胞系在固体表面生长繁殖,在互相接触 　　后,即培养皿长满一单层细胞后停止分裂、增殖。

（２）由癌细胞建立的“癌细胞系” 特点:可在培养皿中以极高的密度增殖， 没有扩展的余地时,可向空间生长。 （３）正常细胞经诱导建立的“转化细胞系” 肿瘤病毒 放射线 化学致癌物 用癌基因转染正常细胞

(3)细胞克隆（Cell cloning） 克隆（clone）：指由同一个祖先细胞通过有丝分裂产生的遗传性状一致的细胞群。 群体培养（mass culture）：将含有一定数量细胞的悬液置于培养瓶 中，让细胞贴壁生长，汇合(confluence)后形成均匀的单细胞层； 克隆培养（clonal culture）：培养高度稀释的细胞悬液，细胞贴壁 生长，每一个细胞形成一个细胞集落，称为克隆。

(4)细胞融合

①定义 在自然或人工条件下，使二个或二个以 上细胞合并形成一个细胞的过程。

②促融方法 生物学方法：仙台病毒 化学方法：PEG(聚乙二醇) 物理方法：电脉冲打孔仪

③应用 A.细胞核和细胞质间的相互作用 鸡红细胞 组织培养细胞 融合 红细胞开始合成RNA,并进行DNA复制

细胞周期相关因子的发现

B.膜蛋白流动性 C.基因定位 由于不明原因，人与鼠细胞融合产生的杂种细胞中会随机丢失染色体，每种杂种细胞仅含有一条或少数几条人染色体。通过对杂种细胞系的分析，就可以了解某一染色体的特殊功能。如仅含有1号染色体的杂种细胞才能合成人尿苷单磷酸激酶，就证明了编码这一酶的基因存在于1号染色体上。

D.单克隆抗体制备 （monoclonal antibody） 单一的抗原 一个B淋巴细胞 特异性抗体 单克隆抗体定义: 从单个B淋巴细胞繁殖的细胞克隆可以得到均质的抗体叫单克隆抗体。

制备过程：1984年Nobel奖 B淋巴细胞＋“不死的”小鼠骨髓瘤细胞 杂交细胞（杂交瘤） B淋巴细胞(产生特异性抗体) 肿瘤细胞(在体外无限增殖) 将每个杂交瘤细胞分别增殖，就得到很多单一细胞 的克隆，一个克隆可以产生一种特异性单克隆抗体。

三、细胞组分的分级分离

1. 超速离心 — 细胞器、大分子

制备细胞匀浆 细胞 匀浆液 方法：●低渗透压 ●超声振荡 ●在细胞膜上打孔 ●强制通过微孔 ●机械破碎或研磨 膜 细胞器 大分子

⑴.差速离心法:用于分离大小、形状显著不同 的组分，根据颗粒沉降速度不同得以分离. ⑴.差速离心法:用于分离大小、形状显著不同 的组分，根据颗粒沉降速度不同得以分离.

⑵.速度沉降 用途:分离密度相近而大小形状略有差异的组分 原理：制备梯度离心介质,分离物按各自的沉降 系数以不同的速度沉降而达到分离。 　　　系数以不同的速度沉降而达到分离。 梯度特点:梯度平缓，密度较低( 5%-20%)，介质的 最大密度应小于被分离生物颗粒的最小 密度。 分离效率: 取决于沉降系数间的差异。

⑶.平衡沉降 用途：分离大小、形态相似而密度不同的组分。 原理：制备梯度离心介质，样品各成分在梯度介质中 　　　经过一定时间的离心则沉降到与自身密度相　 　　　等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而 　　　将不同密度的成分分离。 特点：介质密度高，陡度大(20%-70%）介质最低密 度大于被分离组分的最大密度。 分离效率: 取决于浮力密度间的差异。

2.非细胞体系 由分级分离得到的具有生物功能 的细胞抽提物。 举例： 1. 线粒体、叶绿体 2. 内质网 3.蛋白质合成体系

3.层析 — 分离蛋白质 (1)分配层析 纸层析 薄层层析

⑵柱层析 — 分离蛋白质

A. 离子交换层析 B. 凝胶过滤层析 电荷 大小

C.亲和层析 D.疏水性层析 亲和 疏水性 基质＋抗体 基质＋疏水基团

⑶高压液相层析 ( HPLC） 基质粒度小 分辨率高 分离速度快

4.电泳 — 分析蛋白质、核酸 (1)原理 氨基酸带有正、负电荷，因此蛋白质往往带有净正电荷或负电荷。将含有蛋白质的溶液加上电场，蛋白质分子就会按照它们的净电荷的多少、大小及形状的不同在电场中移动，这一技术称为电泳。

(2) SDS-PAGE — 根据蛋白质分子量、亚单位组成 大小 电荷 形状 √ * 样品处理: SDS(十二烷基硫酸钠) 2- 巯基乙醇(2-ME)/二硫苏糖醇(DTT) *支持体: 单体丙稀酰胺 聚丙烯酰胺凝胶 *染 色: 考马斯亮蓝 特异性蛋白 (western blotting)

动画 Western 印迹技术 将经聚丙稀酰胺凝胶分离的蛋白带转移至硝酸纤维素膜, 然后将膜与特异性抗体作用,膜上特定蛋白条带将与抗体 结合,并进一步与酶标记二抗反应,最终以发色底物显色而 被检测. 基本步骤: (1)SDS-PAGE (2)转膜 (3)抗体反应 一抗孵育 标记二抗孵育 (4)显色 动画

⑶等电聚焦电泳

⑷.双向电泳—蛋白质分子量、等电点 原理：等电聚焦: 等电点 SDS-PAGE: 分子量

5.质谱技术 （2002年诺贝尔化学奖获得者） 原理：通过测定样品离子的质/荷比 来进行成分和结构分析的方法。 应用：蛋白质鉴定

四. 细胞内分子的示踪技术

1.同位素示踪技术——放射自显影术 (autoradiography) 将放射性前体物质掺入细胞，使放 射性分子和细胞内原有的未标记分 子混和，因它们的化学性质相同,细 胞就会不加分辨地利用。

具体操作过 程 ●放射性化合物渗入活细胞 ●培养后取样、固定,进行光镜或电镜切片 ●在暗处把感光乳胶覆盖于切片上，存放在暗处 ●在此期间,放射性同位素衰变使乳胶曝光后显影及定影。根据银粒所在部位，就可知道细胞中放射性物质的分布。 过程

A.细胞内生物大分子的定性、定位 与半定量 蛋白质——放射性同位素标记的 氨基酸 核 酸——放射性同位素标记的 碱基

举例：⑴分泌蛋白在细胞内定位 ① 将胰岛β细胞与3H-亮氨酸共同孵育5分钟， ② 用未标记的亮氨酸冲洗。 ③ 在暗处把感光乳胶覆盖在切片上存放数日。 ④ 放射性同位素衰变使乳胶感光，经过显影和定影，根据感光乳胶黑色银颗粒所在位置即可知道细胞中放射物质的分布情况。

举例：⑵ 大肠杆菌DNA结构的证明

B.示踪细胞中几乎所有的过程 对放射性分子在细胞内存在部位和化学 形式进行追踪，就可测定放射性分子进 入细胞后不同时间所在的位置和化学变 化（光合作用）。

举例：⑴分泌蛋白在细胞内合成、运输及分泌

举例：⑵DNA和RNA在细胞内合成过程 用3H-胸苷、3H-尿苷渗入细胞 DNA在细胞核中合成 RNA在细胞核中合成 并保留在核内 很快累积于细胞质中

2. 抗体示踪技术 A. 抗体 + 荧光素 LM(免疫荧光显微镜)

B. 抗体 + 胶体金 EM(免疫电镜)

C. ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 抗体＋酶 底物 显色 动画 酶

五、分子生物学技术

1.聚合酶链式反应—克隆DNA片断 (polymerase chain reaction，PCR) （1）反应体系：模板链 DNA 聚合酶 dNTP 引物 （primer） （2）反应步骤： 变性 95℃ 退火 45℃～65℃ 延伸 72℃

2.核酸电泳

3.核酸分子杂交—精确检测特定核苷酸序列 原理：碱基互补配对 探针（probe）： 酶 标记物 荧光 放射性同位素

⑴ Southern blotting – DNA probe 细胞中的DNA 动画

动画

⑵ Northern blotting – RNA probe 细胞中的DNA

⑶. 原位杂交技术 （in situ hybridization） 原理 用核苷酸探针对特殊的核苷酸 序列在其原位进行杂交。

荧光原位杂交（FISH） 人类染色体端 粒DNA的荧光 原位杂交照片

3.基因转移技术—蛋白质大量表达 外源基因 原核细胞 转化 真核细胞 转染 基因扩增 蛋白质表达 胰岛素 促红细胞生成素