第三章 重組DNA技術
DNA的剪切與接合 重組DNA分子若少了下列兩類酵素則無法 輕易地製備：限制內切酶就像一把剪刀在 特定專一位置上剪切DNA分子，而DNA接 接合在一起。
圖３－１
表３－１
圖３－２
DNA限制片段的分離與觀察 瓊脂醣凝膠電泳(agarose gel electrophoresis) 是一種可以根據分子大小來分離DNA片段的技術。分離之後的DNA本身在膠體上是看不見的，經由溴化乙錠(ethidium bromide)的添加使得DNA泳動帶可以被觀察到。
圖３－３
DNA選殖 選殖的步驟包括： 分離DNA 把DNA接合到載體 把重組的DNA轉型到宿主細胞中 篩選含有重組DNA的宿主細胞
圖３－４
圖３－５
選殖載體 選殖載體的條件： 具有複製起點，DNA才可以在宿主細胞中進行複製。 必須相當小才能在純化過程中不經裂解就可以分離得到。 使用，也因此載體將只被剪切一次，而且必須擁有許多 可供插入DNA片段之限制酶作用位置可被利用。 具有選擇性的標記可以用來測定選殖媒介是否已轉移至 細胞中或顯示外來的DNA是否已經插入至載體上。
細菌載體 質體(plasmids)： 質體具有多種的功能。有些可轉譯出一些提供對抗生素的抗藥性與細菌素(bacteriocins)～能抑制或殺死與其同類的細菌株或菌種等物質。另一些可提供生理上的功能，例如：色素的製造、化合物的裂解、雙氮的固定等。還有一些可以製造毒素且具有毒性的質體轉譯內毒素與溶血素(hemolysin)，而有些質體則提供對金屬的抗性，例如汞、鎘、鎳、鋅。
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圖３－９
噬菌體(bacteriophage) 可以感染細菌的病毒，我們稱之為噬菌體。病毒的DNA經由遺傳工程操作，已能當作選殖載體使用，最早被使用的是1974年的λ噬菌體。
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圖３－１１
黏接質體(cosmid) 載體 插入DNA大小 特性 質體 ≦10kb 在宿主細胞中會自行複製，具高或低拷貝數目。 噬菌體 5～20kb 包裝進蛋白質外鞘，殺死宿主細胞，具不同的插入大小。 黏接質體 35～45kb 像噬菌體一樣包裝，像質體一樣複製，不會殺死宿主細胞。
其他生物體適用之載體 酵母人工染色體 細菌人工染色體 植物選殖載體 哺乳動物細胞載體
圖３－１２
細胞轉形 利用電穿孔技術(electroporation)的方式可以將外來的DNA分子送入原生質體中：原生質體暴露在短暫的電流脈衝下，細胞膜暫時打開，使DNA分子得以進入細胞，開始轉形。另一轉形細胞的方法是基因槍(microprojectile bombardment或biolistics)。體積相當小的顯微發射器是由金或鎢製成，DNA被粒子槍以極高的速度射入細胞或組織內（不必先去除細胞壁）。基因槍為基因療法的應用帶來希望，藉此在活的動物體內器官細胞可以被修正過的基因加以轉形。
圖３－１３
圖３－１４
基因庫的建構與篩選 基因體基因庫 cDNA基因庫 篩選基因庫 表現基因庫
基因體基因庫， 圖３－１５
cDNA基因庫 利用一個只含有某型式細胞中已表現的基因所構成的基因庫，有時較為可行（例如：黃豆中屬於葉子專一的cDNA）。這種基因庫稱為cDNA基因庫，因為只表現基因體DNA的某一部分，大大地降低了DNA選殖的數量。
圖３－１６
篩選基因庫，圖３－１７
圖３－１８
表現基因庫 表現基因庫(expression libraries)是由含有基因表現所需之調控元件，如：啟動子區域的選殖載體所組成的。
表３－２
報導基因 在很多細胞中，報導基因已經被用來偵測許不同的生物體的基因表現（例如：植物、動物、魚和細菌），其他被利用的報導基因還包括：綠色螢光蛋白(green fluorescent protein, GFP)、β～葡萄糖醛酸酶(β-glucuronidase)基因。
圖３－１９
南方墨點雜合法 在１９７０年代中期，Edward Southern發展了 一個稱為南方墨點法(southern blotting)的簡單 技術，根據此技術將DNA片段從膠片上轉移至 另一片特殊的濾膜上，之後再進行雜合反應。
圖３－２０
圖３－２１
北方墨點雜合法 RNA取代了之前所提的DNA，利用類似於DNA轉漬的方法，也可將RNA從膠體轉移至濾膜上。北方墨點法用於確認所分離到的RNA與研究某特定基因的表現方面是相當有用的。
聚合酶連鎖反應法(PCR) PCR的應用使我們可以很快從所有DNA中分離出我們所要的特定基因或是其它的DNA區域，不須費時於基因庫篩選工作。PCR常見的應用如下： １快速分離特定的序列以提供更進一步的分析或選殖 ２確認特定的遺傳基因座以供臨床或醫藥的應用 ３製作DNA指紋以決定遺傳上的關聯性或刑事鑑定 ４快速進行DNA定序
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圖３－２４
DNA定序 在１９７７年，有兩種DNA定序方法首先被發表出來。哈佛大學A. Maxam與W. Gilbert發現一種可以選擇性分解鹼基的化學定序法。另一種由F. Sanger發展出來的DNA合成法（即試管中的複製作用），此定序法是利用在特定位置上終止剛合成的DNA鏈。在這兩個方法中，DNA都經過標記且利用凝膠電泳分離DNA片段，目前大多數的實驗室都使用Sanger的定序方法。
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蛋白質分析法 蛋白質的相關研究在重組DNA技術領域中是相當重要的一環，因為它是科學家最終試圖進行量與序列上修飾的目標分子。 蛋白質凝膠電泳 蛋白質工程 蛋白質定序
蛋白質凝膠電泳，圖３－２９ 利用電泳可以根據蛋白質的大小與所帶電荷多寡將個別分子加以分離。
圖３－３０
蛋白質工程 藉由蛋白質工程得到的改變包括： 增加穩定度、提高酵素活性、基質專一性的改變、改變酵素在極端條件下或非最適化的情況下的活性表現、提高營養價值。
圖３－３１
蛋白質定序 利用稱為Edman降解法(Edman degradation)操作流程可以決定蛋白質上胺基酸之線性次序。
圖３－３２
DNA微陣列分析技術 DNA微陣列分析已被用在： １分析基因活性（表現）。科學家能決定出哪些 基因具有活性，比如說在一個特定的細胞，組 織或器官中，他們能找出基因表現的變化和物理 或生化過程的變化之間的關聯性，例如光合作用 在光波強弱不同的條件下的變化。 ２跟蹤基因體DNA的改變。許多實驗室利用DNA 微陣列分析技術來分析基因體DNA的改變。舉例 而言，分析發生在癌症細胞中DNA的改變。
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圖３－３４
表３－３
重組DNA技術的應用