核酸扩增检测方法类卫生检疫行业标准验证程序简介 广东出入境检验检疫局 郑夔
内容概要 一、背景 二、为什么制订此程序 三、适用范围 四、谁来执行 五、如何执行 六、验证指标 七、流程图
一、背景 1、满足认监委对标准的管理要求，同时，也是与 国际接轨。 2、为了规范标准中方法类的验证过程，保证标准 方法的科学性、准确性与可适用性。 3、进一步提升方法类标准的制定质量，保证检得 准。
二、为什么制订此程序 方法类行业标准的验证是指通过试验确证，并提供 有效证据以证明符合具体方法应用的特定要求。为 规范核酸扩增检测方法类卫生检疫行业标准的验证 流程，提高本专业检测类方法的科学性、严谨性和 适用性，特制定本程序。
三、适用范围 本程序适用于核酸扩增检测方法类卫生检疫行业标准制（修） 订的过程中方法的验证，核酸扩增检测技术泛指以扩增DNA 或RNA为手段，从而检测特定核酸序列或筛查特定基因的检 测技术，主要包括： 聚合酶链反应（PCR）、 实时荧光聚合酶链反应（Real time PCR）、 依赖核酸序列的扩增技术（NASBA）、 环介导等温扩增技术（LAMP）、 连接酶链反应（LCR）、 转录依赖的扩增反应（TMA）等。 无论该标准是新制定标准、由现有方法转化的标准或由原标 准修订后的标准。此外，实验室采用非标准方法及自主研究 开发新方法时,也可参照本程序用以判断这些方法的适用性。
四、谁来执行 卫生检疫专业标准化技术委员会（以下简称“委员 会”）负责本专业检测方法验证的组织、审核等管 理工作。委员会通过秘书处执行具体职责，包括审 核验证实验室资质，建立并定期更新维护验证实验 室数据库，指定并组织验证实验室开展验证，组织 专家进行验证材料的审核及验证数据的分析等。
五、如何执行 实验室内验证 是指在标准制定方实验室中，于合理的时间间隔内， 在不同条件下，通过对相同或不同的验证样本进行 检测分析，对同一方法的性能指标进行确证的过程。 用于初步判断方法的适用性。 独立实验室验证 独立于标准制定方的实验室内验证。用于复核方法 的性能指标是否能够满足预期的分析目的。
实验室内验证 （1） 标准制定方完成方法草案、 选择合适的验证 参数 （即方法的性能指标） 、并设计实验室内验 证方案。 （2）标准制定方根据所选验证参数完成实验室内 验证，并向秘书处提交验证材料。验证材料应包括 方法草案、验证方案、实验室内验证报告。 （3）秘书处组织专家审核实验室内验证材料的完 整性与符合性。
独立实验室验证 （4）实验室内验证材料审核通过后，秘书处组织独立 于制定方的验证实验室，通过重复测试验证参数（即方 法的性能指标）进行独立实验室验证。 （5）视不同情况选择1家以上独立实验室进行验证： 制（修）订的方法标准属于国内创新的，进行验证的实 验室应当不少于2家；等同采纳国际方法标准的，由标 准制定方或者其他1家实验室进行验证；修改采用国际 方法标准的，进行验证的实验室不少于1家。 （6）验证实验室完成独立实验室验证后，提交结果至 秘书处。 （7）秘书处组织专家审核独立实验室验证结果，并将 验证结果反馈给标准制定方。
六、验证指标 1、特异性试验 特异性是指检测方法只检测被检测对象的能力。检测一定数 量的不含被检测对象的样本，结果应为阴性；检测可能引起 非特异反应的样本，如与被检测对象种属相近、感染部位相 同或感染症状相似的其他样本，结果应为阴性。 2、灵敏性试验 用已知的阳性样本进行试验。可采用对阳性样本进行系列稀 释的方式确定最低检出限量，并与已知样本结果得出的结果 进行比较，根据符合率确定方法的灵敏性。 3、重复性试验 用至少高、低2个浓度水平的阳性对照样本各进行10次重复 测定，计算变异系数（CV，%），方法重复性的合格指标应 为（CV，%）≤5% 。
六、验证指标 4、亚型检测能力 方法的被检测对象可能有多种血清型或基因亚型，标准 制定方规定方法的检测范围如无特殊说明，应能检出所 有包含当前国内外常见的亚型样本。如未能获得更多的 亚型样本，则应根据方法中提供的引物、探针等寡核苷 酸序列进行理论上的验证。 5、干扰试验 人体或媒介动物的血液、组织、排泄物等样本可能含干 扰核酸扩增检测的物质，如脂血样本、血液样本的 EDTA 抗凝剂、粪便样本中的复杂成份等。标准制定方 应对方法的检测样本范围作相应的规定，验证试验时可 将至少高、低2个浓度水平的阳性对照样本加入相应的 含干扰成份阴性样本中，按拟定的方法进行干扰试验。
七、流程图