尿液标本的细 菌学检验

案例 小晋，男， 30 岁，是一家公司的 经理，常常和朋友或客户去酒吧 喝酒。一次在酒吧，喝酒时结识 了一位女性，那晚他们便去酒店 开了房。大约五天后，小晋发现 了身上的不对劲，自觉尿痛、尿 频。还出现了尿道口红肿，尿道 粘液性分泌物增多，尿道口流脓 等症状。请问患者是哪种细菌感 染？如何进一步鉴定？ 小晋，男， 30 岁，是一家公司的 经理，常常和朋友或客户去酒吧 喝酒。一次在酒吧，喝酒时结识 了一位女性，那晚他们便去酒店 开了房。大约五天后，小晋发现 了身上的不对劲，自觉尿痛、尿 频。还出现了尿道口红肿，尿道 粘液性分泌物增多，尿道口流脓 等症状。请问患者是哪种细菌感 染？如何进一步鉴定？

一 标本采集： 1 采集方法： 最好留取早晨清洁中段尿标本。首先用肥皂水清洗 会阴部及尿道口，在用清水冲洗，嘱患者排弃前段尿液，收集中段 尿 10-20ml 直接排入专用的无菌容器中，加盖立即送检。 2. 标本运送与保存： 尿液标本采集后应立即送检、及时接种，室 温下保存时间不能超过 2 小时， 4 ℃冷藏时间不能超过 8 小时，否则 尿液细菌迅速繁殖，使尿中细菌计数不准确。但疑为淋病奈瑟菌感 染患者的标本不能冷藏保存。 3 注意事项： （ 1 ）．采集尿液标本应在使用抗菌药物之前进行，防止药物对细 菌的抑菌作用。 （ 2 ）．应取清晨第一次尿液送检。 （ 3 ）．尿液采集应严格进行无菌操作，防止污染。 （ 4 ）．标本采集后立即送检，一般不超过 1h 。否则由于细菌的繁 殖影响结果的正确性。 （ 5 ）．应注意不要让外阴消毒剂混入标本，引起抑菌后果。

二细菌学检验： 检验程序：

检验方法： （一）涂片法  1 ．一般细菌涂片 以无菌操作取尿液 10ml 左右放入无菌试管 中，经 3 000r/min 离心 l5min ，弃去上清液，取沉渣涂片，进 行革兰染色，如发现革兰阳性或革兰阴性菌，可根据细菌的 染色性和形态，做出初级报告。  2 ．疑为假丝酵母菌 取尿液离心沉淀物置于清洁玻片上， 加盖玻片后用高倍镜观察，若沉渣太多，可滴加 10 ％左右的 NaOH ，使沉渣溶解后再镜检，或制成涂片革兰染色油镜检 查，如发现革兰阳性卵圆形芽生孢子或假菌丝，即可做出初 级报告。  3 ．疑为淋病奈瑟菌 取尿液沉淀物置于清洁玻片上，制成 涂片，革兰染色，油镜检查，如发现革兰阴性双球菌，呈肾 型，存在于细胞内或细胞外，即可做出初级报告。  4 ．疑为结核分枝杆菌 取尿液 l0ml 左右经 3 000r/min 离心 30min ，取沉渣涂片，进行萋一纳及潘本汉染色，若两种涂 片均查见红色杆菌，即报告 “ 找到结核分枝杆菌 ” ，如萋 - 纳染 色找到红色杆菌，而潘本汉染色中未发现红色杆菌，则为耻 垢分枝杆菌，也可用全胺 “o” 荧光法进行染色后镜检。

淋病奈瑟菌（ 革兰阴性 双球菌，呈肾形） 结核分枝杆菌

本标本实验结果为： 初步报告： 报告 “ 找到革兰阴性、肾形或豆形、成双排 列、凹面相对的球菌，多位于吞噬细胞内，少部分在细 胞外，形似淋病奈瑟菌 ” 。

（二）培养检查： 1 ．一般细菌培养 用无菌接种环取尿液接种于血琼脂平板和 麦康凯 Macc( 或中国蓝 EMB) 平板上， 35 ℃培养 18 ～ 24h ，观 察结果，根据菌落形态特征及涂片镜检结果，选择相应方法 作进一步鉴定，如培养 48h 无菌生长，则可报告 “ 无细菌生 长 ” 。 2 ．特殊细菌培养 (1) 淋病奈瑟菌培养：尿标本收到后立即接种于预温 35 ℃的 巧克力琼脂平板，置 35 ℃ 5 ％～ l0 ％ C02 环境中培养。 (2) 结核分枝杆菌培养：将尿液接种于血琼脂平板上， 35 ℃ 培养 18 ～ 24h 后无细菌生长，可将尿液 3 000r/min 离心 30min 后取沉淀物 0.1ml 接种在罗氏培养基上。 (3) 假丝酵母菌培养：将尿液接种沙保弱琼脂平板上， 25 ～ 30 ℃培养。 (4) 厌氧菌培养：用穿刺尿进行培养，接种厌氧血琼脂平板， 厌氧环境中培养。

对本标本进行分离培养： 培养基种类：血琼脂平板、巧克力平板、麦康凯培 养基 （待检菌在对应培养基中的生长状况，如图） 血平板麦康凯平板巧克力平板 菌落特征： 生长出现呈圆形凸起、半透明或不透明、无色或灰白色、边缘整齐、 直径为 mm 的小菌落。

（三）定量培养： 11 ．平板接种法 用定量加样器取 5ul 尿液滴注在琼脂平板上， 用接种环涂抹均匀， 35 ℃培养 24h ，生长的菌落数乘 200 ， 即为每毫升尿中细菌数。 22 ．定量接种环法 用定量接种环蘸取尿液标本 (10p1) 在血琼 脂平板上作均匀划线接种，置 35 ℃培养 24h ，计数生长的菌 落数乘以 100 ，即为每毫升尿中细菌数，若平板上菌落数超 过 l 000 个，则报告：菌落数 >105CFU/ml 。 33 ．倾注平板法 取被检尿液 0.1ml ，加入 9.9ml 无菌生理盐水 中充分混匀，取此液 lml 放入直径为 9cm 的无菌平皿内，同时 加入已融化并冷却至 50 ℃的琼脂培养基与尿 液液混匀，凝固后置 35 ℃培养 24h ，计数生长菌落乘 l00 即为每 毫升的菌落数。 若若革兰阴性杆菌尿液计数 <104/ml 可判断为污染， >105/ml 可 判断为感染， 104/ml-105/ml 为可疑需重复检查。对于革兰 阳性球菌而言尿液菌落计数 >104/ml 可判断为感染菌。 每毫升尿液中细菌数 = 平板上的菌落数 1/ 接种环含尿量（ ml ）

（四）生化反应 待检菌落 氧化酶试验氧化酶试验 触酶试验触酶试验 Glu 、 麦芽 糖、 蔗糖 发酵 试验 KIH 硝酸盐还 原试验 IMViC MIU IDN MR VP CRT MOTIND URE

（一）氧化酶试验： 实验原理：奈瑟菌等产生氧化酶，能将盐酸二 甲基对本二胺或盐酸四甲基对苯二胺氧化成有 色的醌类化合物。 方法：用白色滤纸条沾取被检菌落，滴加 10 克 /L 盐酸二甲苯对本二胺试剂 1 滴于滤纸条的菌 落上，立即观察结果。 结果判断、解释和报告：立刻出现红色，继而 逐渐加深为紫红色为阳性，（如加盐酸四甲基 对苯二胺试剂，呈蓝紫色为阳性）。不变色为 阴性。氧化酶试验阳性是奈瑟菌属的共同特征。

滴加 10 克 /L 盐酸二甲 苯对苯二胺 菌落 逐渐 试验结果： 阳性 逐渐 菌落

（二）触酶试验 ; 1. 原理：触酶又称过氧化氢酶，具有过氧化氢酶的细菌，能 催化过氧化氢成为水和原子态氧，继而形成氧分子，出现 气泡。 2. 方法：取洁净玻片 1 张，用接种环挑取细菌，加 3%H2O2 1 滴，立即观察结果。 试验结果：阳性 （三）葡萄糖、麦芽糖、蔗糖发酵 试验 : (+) ( 四 )KIA 试验：只分解 GLU ，不 分解其他糖类。

（五）硝酸盐还原试验：（阴性） （六） IMViC ： 吲哚 IDN + 甲基红 MR + VP - 枸橼酸盐 CRT - （七） MIU ： 动力 MOT + 吲哚 IND + 脲酶 URE ＋

药敏试验： 对壮观酶素、青霉素、四环素敏感性较高， 对头孢类、环丙沙星类有一定的耐药性

三 结果报告： 1 、尿沉淀涂片镜检时，普通细菌根据形态及染色性，报 告 “ 找到革兰 × 性 ×× 细菌 “ 。如见到革兰阴性双球菌、肾形、 存在于细胞内（外），报告 ” 找到革兰阴性双球菌，存在 于细胞内（外），形似淋病奈瑟菌 “ ；见到革兰阳性、卵 圆形的 芽生孢子和管状假菌丝，报告 ” 找到酵母样细菌， 形似白假丝酵母菌 “ ；抗酸染色见到抗酸阳性杆菌，可报 告 ” 找到抗酸杆菌 “ 。 2 、尿液细菌计数革兰阳性细菌大于 10^4CFU/ml 、革兰阴 性杆菌大于 10^5CFU/ml 有诊断意义。分离培养后，立即 进行微生物学鉴定及标准化的药敏实验，最后报告 “ 检出 ⅹⅹ细菌 ” ，并报告药敏实验结果。 3 、培养 48 小时仍无细菌生长者，报告 “ 48 小时培养无细菌 生长 ” 。

报告： 检出 “ 淋病奈瑟菌 ” 药敏结果：对壮观酶素、青霉素、四 环素敏感性较高，对头孢类、环丙沙 星类有一定的耐药性 终报告：小晋得急性淋病