课题3　分解纤维素的微生物的分离

课程标准 1.研究培养基对微生物的选择作用。 2.探讨微生物的利用。 课标解读 1.简述纤维素酶的组成及作用。 2.掌握从土壤中分离某种特定微生物的操作技术。

纤维素分解菌的筛选 C1酶 复合 Cx酶 葡萄糖苷酶 葡萄糖苷酶 C1酶、Cx酶

2．纤维素分解菌的筛选 (1)筛选方法： 法。 (2)筛选原理：刚果红可以与纤维素形成 ，当纤维素被 分解后，刚果红——纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现 ，我们可以通过 来筛选纤维素分解菌。 刚果红染色 红色复合物 纤维素酶 以纤维素分解菌为中心的透明圈 是否产生透明圈

[思维激活1] 纤维素分解菌的选择培养基中“选择因子”是什么？ 提示　纤维素分解菌中唯一的碳源是“纤维素粉”，唯有能利用纤维素的微生物方可在该培养基上生存，其他微生物将因缺乏碳源而无法生存，以此，可筛选到纤维素分解菌。

1．纤维素分解菌的筛选原理 即：可根据是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。

2．筛选过程中涉及的两种培养基 (1)纤维素分解菌的选择培养基 ①配方： 组分 含量/g 提供的主要营养 纤维素粉 5　 碳源、能源 NaNO3 1　 无机盐 Na2HPO4·7H2O 1.2 KH2PO4 0.9 MgSO4·7H2O 0.5 KCl 酵母膏 生长因子、碳源、氮源 水解酪素 氮源、生长因子 将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1 000 mL

②该培养基为液体培养基，利用液体选择培养基可增加纤维素分解菌的浓度。 (2)鉴别纤维素分解菌的培养基 ①配方： 组分 含量 提供的主要营养 CMC－Na 5～10 g 碳源 酵母膏 1 g 碳源、氮源、生长因子 KH2PO4 0.25 g 无机盐 琼脂 15 g 凝固剂 土豆汁 100 mL 将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1 000 mL

②此培养基为固体培养基——在其中加入刚果红可形成以纤维素分解菌为中心的透明圈，据此可筛选到纤维素分解菌。

【巩固1】 分析下面培养基的配方，请回答下面的问题。 纤维素分解菌的选择培养基： 纤维素粉　　　　　　 5 g NaNO3 1 g Na2HPO4·7H2O 1.2 g KH2PO4 0.9 g MgSO4·7H2O 0.5 g KCl 0.5 g 酵母膏 0.5 g 水解酪素 0.5 g

将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1 000 mL。 (1)此培养基配方中为微生物提供碳源和氮源的分别是______、______。 (2)此配方为______培养基(根据物理状态)。 (3)此培养基选择出的微生物主要是_________________________。

解析　该培养基的唯一碳源是纤维素粉，氮源有NaNO3、酵母膏。因没有凝固剂成分，因此，该培养基从物理状态上看属于液体培养基。因该培养基仅以纤维素粉为唯一碳源，因此，可用于选择培养纤维素分解菌。

分离土壤中纤维素分解菌实验操作 1．分离纤维素分解菌的实验设计 (1)实验流程：土壤取样→ (此步可省略)→梯度稀释→将样品涂布到鉴别 的培养基上→挑选产生 的菌落。 (2)土壤取样 采集土样时，可以选择 的环境。 选择培养 纤维素分解菌 透明圈 纤维素丰富

(3)选择培养 ①目的：增加纤维素分解菌的 ，确保能够从样品中分离到所需要的 。 ②选择培养：称取土样20 g，在无菌条件下加入装有30 mL培养基的锥形瓶中，将锥形瓶固定在 上，在一定温度下振荡培养1～2 d，直至培养液变 。也可重复选择培养。 浓度 微生物 摇床 混浊

③挑选菌落 a．刚果红染色法，挑选 的菌落，一般即为分解纤维素的菌落。 b．常用的刚果红染色法包括两种，一种是先 ，再加入 进行 反应，另一种是在 时就加入刚果红。 产生透明圈 培养微生物 刚果红 颜色 倒平板

对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖 2．课题延伸 (1)为确定得到的透明圈中的菌落是纤维素分解菌，需要进行 的实验，纤维素酶的发酵方法有 和 两种。 (2)纤维素酶的测定方法 一般采用 。 发酵产纤维素酶 液体发酵 固体发酵 对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖 进行定量测定

[思维激活2] 由“选择培养”实验操作过程请你推测纤维素分解菌的异化类型是需氧型还是厌氧型？ 提示　由选择培养操作中“将锥形瓶置于摇床上”可推测纤维素分解菌的异化类型为需氧型。

1．土壤中纤维素分解菌的分离流程

2．两种刚果红染色法比较

显示出颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用 优点 显示出颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用 操作简便，不存在菌落混杂问题 缺点 操作繁琐，加入刚果红会使菌落之间发生混杂 ①由于琼脂、土豆汁中均含有淀粉类物质，可能使产生淀粉酶的微生物也形成透明圈，即假阳性反应；②有些微生物具有降解色素的能力，它们会降解刚果红形成透明圈，与纤维素分解菌不易区分

特别提醒　(1)本实验方案中应设置普通培养基(或牛肉膏蛋白胨培养基)作为对照实验。 (2)分离纤维素分解菌先经选择培养，其目的是增加纤维素分解菌的浓度；然后经梯度稀释后，再涂布到鉴别培养基上。

【巩固2】 下列关于分离纤维素分解菌实验的叙述，错误的是 (　　)。 A．经选择培养后将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上 B．选择培养这一步可省略，但培养纤维素分解菌少 C．经稀释培养后，用刚果红染色 D．对照组可用同样量的培养液涂布到不含纤维素的培养基上 解析　经选择培养后，再经稀释，才能将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上；选择培养可省略；经稀释培养后，用刚果红染色；设置对照能证明经选择培养的确得到了欲分离的微生物。 答案　A

纤维素和纤维素酶 【例1】 微生物体内能够使纤维素分解成纤维二糖的酶是( )。 A．C1酶和Cx酶 B．C1酶和葡萄糖苷酶 【例1】 微生物体内能够使纤维素分解成纤维二糖的酶是(　　)。 A．C1酶和Cx酶 B．C1酶和葡萄糖苷酶 C．Cx酶和葡萄糖苷酶 D．C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶 深度剖析　纤维素酶包括C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶，能将纤维素分解为纤维二糖的是C1酶和Cx酶。 答案　A

[查漏补缺](1)纤维素、纤维素酶、控制纤维素酶合成的基因，其基本单位依次为：葡萄糖、氨基酸、脱氧核苷酸。 (2)纤维素酶是复合酶，它并非一种单一酶。

土壤中纤维素分解菌的分离与检测 【例2】 生物乙醇是以生物为原料生产的可再生能源。我国利用农作物废弃物(秸秆)生产乙醇，其技术流程为：纤维素酶解→酵母发酵→蒸馏→成品。纤维素酶的成本能否下降，是能否实现乙醇工业化生产的关键因素。纤维素酶可以从能分解纤维素的细菌培养液中提取。某同学设计了如下分离土壤中纤维素分解菌的实验流程。 土壤取样→选择培养→梯度稀释→鉴别培养。

结合所学知识回答下列问题。 (1)最好选择怎样的环境采集土样？ ___________________________________________________。 (2)下面是一种培养基配方：纤维素粉5 g、NaNO3 1 g、Na2HPO4·7H2O 1.2 g、KH2PO4 0.9 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、KCl 0.5 g、酵母膏0.5 g、水解酪素0.5 g(蒸馏水定容到1 000 mL)。该培养基能够增加样品中纤维素分解菌的浓度，其原理是____________________________________________________ ___________________________________________。

(3)为了鉴别纤维素分解菌和进一步纯化菌种，可以在鉴别培养基上加入______染液，将筛选获得的菌液稀释后用______的方法接种到鉴别培养基上，然后挑选产生______的菌落作为菌种进行扩大培养。 (4)纤维素分解菌培养液中的纤维素酶产量如何呢？请设计实验进行检测。__________________________________________。

深度剖析　本题考查土壤中纤维素分解菌的分离与鉴定的相关知识。富含纤维素的土壤中，含有以纤维素为碳源的纤维素分解菌，且数量较多；题目中给出的培养基能够为产生纤维素酶的微生物提供碳源，不能分解纤维素的微生物由于缺乏碳源而不能正常生长繁殖，因此该培养基具有选择作用；纤维素量一定时，在一定范围内，纤维素酶产量与分解产生的葡萄糖量成正比。 答案　(1)纤维素丰富的土壤环境　(2)培养基中纤维素是主要碳源，有利于纤维素分解菌生长，同时抑制其他微生物生长　(3)刚果红　涂布平板　透明圈　(4)向纤维素分解菌培养液中加入定量纤维素，定时测定葡萄糖产量的变化

[归纳提升](1)经选择培养后，再经梯度稀释，才能将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上。(2)富集培养可省略。(3)经稀释培养后，用刚果红染色。(4)设置对照能证明经富集培养的确得到了欲分离的微生物。

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旁栏思考题 1．本实验的流程与课题2中的实验流程有哪些异同？ 解析　本课题的选择培养可以提供目的微生物繁殖所需的条件，增加选择培养可以使实验的成功率更高。 答案　本实验流程与课题2的流程的区别如下：课题2是将土样制成的菌悬液直接涂布在以尿素为唯一氮源的选择培养基上，直接分离得到菌落。本课题通过选择培养，使纤维素分解菌得到增殖后，再将菌液涂布在选择培养基上。其他步骤基本一致。

2．为什么要在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌？ 答案　由于生物与环境的相互依存关系，在富含纤维素的环境中，纤维素分解菌的含量相对较高，因此从这种土样中获得目的微生物的几率要高于普通环境。

3．将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应该埋进土壤多深？ 答案　将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对聚集，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。一般应将滤纸埋于深约10 cm左右腐殖土壤中。

4．想一想，这两种方法各有哪些优点与不足？你打算选用哪一种方法？ 解析　两种方法各有优缺点，实践中可以根据需要选择不同的方法进行实验。 答案　方法一是传统的方法，缺点是操作繁琐，加入刚果红溶液会使菌落之间发生混杂；其优点是这样显示出的颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用。方法二的优点是操作简便，不存在菌落混杂问题，缺点是由于纤维素和琼脂、土豆汁中都含有淀粉类物质，可以使能够产生淀粉酶的微生物出现假阳性反应。

但这种只产生淀粉酶的微生物产生的透明圈较为模糊，因为培养基中纤维素占主要地位，因此可以与纤维素酶产生的透明圈相区分。方法二的另一缺点是：有些微生物具有降解色素的能力，它们在长时间培养过程中会降解刚果红形成明显的透明圈，与纤维素分解菌不易区分。

5．为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物？ 解析　这里的选择培养的实质是富集培养，也就是提供了目的微生物生长繁殖的条件。 答案　在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“浓缩”的作用。

练习 1．略。(开放性题目，答案合理即可) 2．提示　土壤取样→选择培养(此步是否需要，应根据样品中目的菌株数量的多少来确定)→梯度稀释→将菌悬液涂布到有特定选择作用的培养基上→挑选单菌落→发酵培养。