蛋白質的純化與分析─ 管柱層析法與蛋白質電泳 李冠群、黃璧祈

一、管柱層析法 (Column chromatography) 純化蛋白質的主要方法 應用於化學、化工、食品、生化、及醫藥等各類領域 主要原理: 不同大小流體分子通過不互溶固相分子，會有不同的流出速度，藉由蒐集先後流出的溶液以獲得純化的蛋白質。

（一）層析法種類： 膠體過濾或分子篩 (Gel Filtration or Size Exclusion) 離子交換層析法 (Ion-Exchange Chromatography) 疏水性作用層析法 (Hydrophobic Interaction Chromatography (HIC)) 親和性層析法 (Affinity Chromatography) 例如固定化金屬離子親和性層析法 (Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC)) 分配層析法 (Partition Chromatography) 高效能(高壓)液相層析法 (High-Performance (Pressure) Liquid Chromatography) 本實驗操作親和性層析法之固定化金屬離子親和性層析法

(二)親和性層析法原理： 三大步驟： 結合(Binding) 洗滌(Washing) 沖提(Elution) 兩種可以專一性結合的分子，固定在某材質上的分子稱為配體(ligand) 。 我們可以利用耦合反應 (Coupling Reaction)讓水溶性的配体接到固相擔体(固體基質)上，成為固定相。 例如蛋白質X與配体(Y)之間有專一性親和力 欲純化蛋白質X時，只要將配體Y固定在管柱的擔體上，讓含有雜質的蛋白質X溶液通過管柱， 管柱內的配體Y會抓主蛋白質X，而其他雜質則會通過管柱流出。 最後再用特殊方法把結合的X-Y複合體分開溶離(elution)出來，即可得純化的蛋白質X。 可分三大步驟: 1.Loading 2.Washing 3.Elution溶離(流析)

(三)本單元介紹固定化金屬離子親和性層析法 (Immobilized Metal Affinity Chromatography, IMAC) 擔體 IMAC最早稱之為Metal Chelate Affinity Chromatography，係以不動的轉移金屬離子(immobilized transition metal ion）如Co2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+等，依據其離子態與含有短片段的affinity-tag(如Histidine-tag)吸附或相互作用來純化或分離蛋白質 鎳離子 六個 His 的片段 imidazole

c. 基因操作時，經常在表現蛋白質的端點，加上一段含有六個 His 的片段；則此表現蛋白質，可以吸附到含有鎳的固相擔體上，並且可以 imidazole 流洗出來。  Histidine tag (His-tag)包含4到10個的Histidine residues，是根據immobilised metal-ion affinity chromatography (IMAC)的原理用來純化recombinant蛋白質的方式，IMAC最早稱之為Metal Chelate Affinity Chromatography，是以不動的轉移金屬離子(immobilized transition metal ion，譬如Co2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+等)依據其離子態與含有短片段的affinity-tag(如Histidine-tag)吸附或相互作用來純化或分離蛋白質。由於histidine與這些金屬離子結合能力很高，於是早在1987年時即以Ni2+離子與His-tagged方式純化蛋白質一直到現在。His-tag在重組蛋白質(recombinant protein)表現時可以設計在N端或是C端表面的位置上，並且可以運用於各種的蛋白表現系統如細菌、yeast、昆蟲細胞或mammalian細胞，優點是分子量小(僅4到10個胺基酸序列)，所純化出來的蛋白質量高，不易干擾蛋白質本身的功能與活性，同時將此fusion tag切除也很方便。其應用可作蛋白質結構分析、蛋白質與蛋白質間相互作用….等等。 鎳離子 六個 His 的片段 imidazole

d. 這種擔體上結合有某些可與金屬產生配位鍵的基團 (如 nitrilotriacetic acid)，這些基團與金屬離子結合 (如鎳離子) 後，即可成為親和吸著劑。 六個 His 的片段 imidazole

Histidine tag (His-tag) 早在1987年時即以Ni2+離子與His-tagged方式純化蛋白質一直到現在。 His-tag基因可以設計成重組蛋白質(recombinant protein)表現時是接在N端或是C端表面的位置上 可以運用於各種的蛋白表現系統 細菌 Yeast 昆蟲細胞 mammalian細胞 優點 分子量小(僅4到10個胺基酸序列) 純化出來的蛋白質量高 不易干擾蛋白質本身的功能與活性 切除此fusion tag很方便 應用廣

如何沖提(Elution)? 下列三種方法之一可將藉由組胺酸 (histidine)與樹脂結合的蛋白質沖提出來： 降低動相緩衝液的pH值，讓組胺酸(Histidine)變為正電而失去其與金屬離子的親和性。 添加比在IMAC擔體上還強的金屬嵌合劑(例如：EDTA 增加動相中與蛋白質競爭金屬鍵結之物質的濃度(例如：咪唑(imidazole)或組胺酸(histidine))。

蛋白質A 蛋白質B 金屬離子親和層析法示意動畫 鎳離子 擔體 加入樣品與吸附

蛋白質A 蛋白質B 加入緩衝液 鎳離子 擔體 washing

溶離 鎳離子 擔體 加入降低緩衝液的pH值使偏向帶正電 蛋白質A 蛋白質B (或EDTA或咪唑(imidazole)或組胺酸(histidine)) 鎳離子 擔體 溶離

流出物檢測(直接測定生成物) 從管柱物不同時間內所溶離之物質需檢測是否為純化之目標蛋白質。 如所製造之蛋白質為Esterase (酯酶) ，則可以檢測酶之活性做為指標。

檢測原理 利用p-nitrophenyl butyrate作為受質測定esterase活性 ＋ Esterase 黃色

(四)層析及檢測實驗示例 鐵架 微量吸管及管架 層析管柱 振盪器 液態氮槽 離心管及管架

實驗流程：(非自動化儀器) 破菌 粗萃取 Loading Washing Elution product test

1、破菌 加入4 mL Binding buffer至誘導過的菌體中，votex使菌液均勻混和，置於液態氮中急速冷凍→37 ℃恆溫水槽解凍，連續三次，進行破菌。 菌液 3次 37 ℃水浴解凍 液態氮冷凍

2、粗萃取 將破菌液分裝至四支的微量離心管，4 ℃離心，12000 rpm，10 min，以去除未破的菌及菌體的殘骸，所得的上清液即為蛋白質粗萃取液。(保留50 ul蛋白質粗萃取液於一支乾淨微量離心管並註明sample 1)

3、加入管柱(Loading) 以滴管取4 mL的Binding buffer加入管柱以平衡膠體，流洗液不收集。 待管柱內液面降至接近膠體時，封閉管底，加入1 mL蛋白質粗萃取液(含有6xHis-酯酶)到已平衡好的管柱內，打開管底讓流洗液流出(不收集)。 封閉管底

注意： 每當換加入不同溶液至管柱時，必須待上一批溶液流洗完畢，封閉管底，再加入下一種溶液，以確保每次溶液的濃度不致改變 避免管柱內的液體流乾，導致膠體內產生氣泡及空隙，以減少膠體與溶液的接觸面積 溶液應延管壁緩慢加入，避免溶液沖起膠體。

4、洗滌 加入4 mL的Washing buffer將不吸附的蛋白質(不含6x His)自管柱中洗出，開始以一管1 mL收集流洗液。（並標示為W-1~W-4）

5、沖提(Elution) 接著加入4 mL的Elution buffer將6xHis-酯酶沖提出，並且收集流洗液四管(一管1 mL)。（並標示為 E-1~E-4）

6、活性檢測(product test) 分別取p-nitrophenyl butyrate Reagent 100 uL加入sample 1、W-1~W-4、E-1~E-4各5 uL 室溫下作用3 min觀顏色變化，以確認所純化的esterase。

二、蛋白質電泳 本實驗以SDS-PAGE膠體電泳分離蛋白質為例。 SDS-PAGE全名為： Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis 十二烷基硫酸鈉－聚丙烯醯胺膠體電泳 SDS-PAGE常被用來測定所製備的蛋白質樣本中蛋白質鏈或蛋白質次單元鏈的數目及大小。

(一)電泳(Electrophoresis)原理 帶電分子在電場中會被電流移動，是為 泳動 泳動的大小程度稱為 泳動率(mobility) Juang RH (2005) Biochemistry 25

泳動率與分子上 電荷密度 成正比，而與其分子 摩擦力 成反比： (所外加 電壓 mV) × (分子之 淨電荷密度) 泳動率  =  ──────────────── 分子與介質間之 摩擦力 摩擦力取決於此分子量大小及形狀。 分子量大者摩擦力大，泳動率小；球形分子摩擦力較小，泳動率大。 26

(二)應用SDS 膠体電泳於蛋白質分子量的測定 SDS 是界面活性劑，可使蛋白質變性，並在分子表面均勻佈上一層負電荷。 因此在 SDS-PAGE 系統中，樣本分子的泳動率，僅取決於其分子量，而與原來分子所帶的電荷無關，故 SDS-PAGE 可用來測定變性狀態 (denatured) 蛋白質之 分子量。

(三)以過量的硫醇(thiol)及SDS使蛋白質變性

Juang RH (2005) Biochemistry SDS 使蛋白質變性的原理 SDS 有一個極性頭部，與一條非極性尾巴。因此 SDS 可以介入極性與非極性基團之間，是一種界面活性劑，就是俗稱的清潔劑。 SDS 可以把非極性尾巴鑲入蛋白質三級構造的內部，而以其極性頭部與外界的水分子結合，因而使得蛋白質變性。 Juang RH (2005) Biochemistry

Juang RH (2005) Biochemistry SDS 覆蓋蛋白質表面敷上一層負電荷 理論上 SDS 是很均勻的吸附到蛋白質上，因此不管原來蛋白質分子的大小，每種蛋白質分子上所吸附的負電荷密度是相同的。 Juang RH (2005) Biochemistry

Juang RH (2005) Biochemistry (四)電泳的焦集作用 電泳裝置之組成 Juang RH (2005) Biochemistry

Juang RH (2005) Biochemistry 什麼是焦集作用? A：上述組成電泳的五個部分中，只有膠体的緩衝液含氯離子；而樣本溶液中則含有 glycine，沒有氯離子。 注意 樣本溶液-焦集膠体-分離膠体 三段的 pH 是不連續性的，其 pH 分別為 8.3-6.9-8.3，而 glycine 的 pI 恰為 6.9。 B：電泳一開始 glycine 進入焦集膠体，立刻變成不帶電的的分子 (白點)，泳動率變小； 同時氯離子則很快的往正極泳動，因此在氯離子與 glycine 之間有一段缺乏離子的空間，電壓變得很高。 然而兩電極之間，要有負離子來帶動電流，此時只得利用蛋白質來傳導。而焦集膠体中的孔隙較疏，於是樣本分子不論大小，在此離子缺乏空間，全部快速往正極泳動，一直碰到氯離子的尾端聚集成一薄層。 C：Glycine 慢慢通過焦集膠体，變回負離子，離子缺乏帶瓦解；蛋白質泳動到分離膠体，開始依其分子量、電荷等因素泳動。 Juang RH (2005) Biochemistry

Juang RH (2005) Biochemistry Glycine： 圖中以黑點 (當環境 pH > 6.9時，帶負電) 或白點 (當環境 pH = 6.9 時，不帶電之 zwitterion) 表示。 氯離子： 以斜線部分表示。 樣本分子： 以兩種大小蛋白質為例。 Juang RH (2005) Biochemistry

Juang RH (2005) Biochemistry (五)染色及乾燥 膠片在電泳後要進行染色，才能看到樣本蛋白質所呈現的色帶。 Coomassie Brilliant Blue R-250 (CBR) 染色： 最常用的染色法，快速而方便，靈敏度中等。利用 CBR 上的芳香基團與蛋白質的非極性區結合，以及所帶負電與蛋白質的正電基團結合。注意染色用的 Coomassie Blue 為 R-250，不要誤用 G-250，後者用在蛋白質定量。 膠片乾燥法 ：大部分的膠片均可利用 玻璃紙三明治法 進行乾燥，效果相當良好。乾燥好的膠片，可用掃瞄機 (scanner) 掃瞄，再以記錄器畫出色帶的位置及高度，與標準品比較則可定量。 乾燥後的膠片，再經過熱膠膜護貝後可以長期保存。 Juang RH (2005) Biochemistry

實際電泳裝置圖(一) 器材：Mini-PROTEAN® 3 Cell

實際電泳裝置圖(二)

(六)電泳方法： 若膠片組合保存於4℃，則要等待膠片完全回復室溫，才架到電泳槽。( 膠片一定要完全回溫，否則在進行電泳時，玻璃會因熱脹而破裂。) 取running buffer溶液，先倒入下方的正極槽，注意不可有氣泡黏在膠體，然後倒入上方的負極槽。用微量針筒或微量吸管一個一個清洗樣本槽(wells)，除去殘留在槽內的膠體 (刷牙)。

取蛋白質樣本溶液，加入1/6體積的6 × sample buffer(15 ul protein + 3 ul sample buffer)，混勻後在100℃加熱10 min。放冷短暫離心後即可依次以微量吸管取10 μL注入樣本槽，另外取5 μL marker直接注入樣本槽，不必加熱處理。 (注入樣本時，儘量把針頭或吸管伸到樣本槽底部，但不要觸到樣本槽底的膠面，則可以使得樣本所佔的體積最小，分離效果較好。)

裝上電源蓋，以120 V進行電泳，視實驗的緊急程度，以及膠片發熱的情形而定。通電後兩極附近會立刻產生無數細微氣泡，是通電的特徵。 追蹤染料很快進入膠體，開始焦集成藍色細線，並向下泳動，大約1 h 可泳動到底邊，中止電泳，除去電源蓋。

(七)膠片染色法： 取出膠片組合，輕輕撬起小片玻璃，膠片則留在大片玻璃上。切除焦集膠體，並在分離膠片的右上方截角做記號 (區別膠片的左右)。 取染色盤 (大約比膠片稍大)，倒入CBR染色液，挑起膠片一角，利用重力使膠片掉落到染色缸中。

在CBR 中染色約30 min，染色盤要加密蓋，置於旋轉平台慢速50 rpm 搖盪之；要注意膠片是否完全沒入染色液中，否則會造成染色不均勻。 染色後小心把CBR 染劑倒回原來瓶中，整塊膠片變成藍色，先用自來水洗掉殘餘的染色液，再倒入約20 mL 脫色液，加密蓋後再放回旋轉平台搖盪。染色脫色過程請戴手套，否則會在膠片上留下指紋。

膠片的藍色背景漸漸脫掉，待脫色液轉成藍色後，可以換新脫色液；如此脫色數次，在一小時內應可看到蛋白質的藍色色帶出現。(用過的脫色液，請回收倒在有機溶液的廢液桶中。) 待膠片背景完全透明後，染色脫色完成。倒去脫色液，改用50%甲醇液洗一兩次，待膠片縮至大約原來的尺寸，則可準備乾燥之。

(八)膠片乾燥法： 把玻璃紙先用水浸溼，平鋪在乾燥用的玻璃片上，玻璃紙會比玻璃片大，因此四週有多出來的部份。 把膠片平鋪在玻璃紙中央，膠片與玻璃紙間不要有任何氣泡。

在膠片上再加一層浸溼的玻璃紙，也不要陷有氣泡在內；把玻璃紙多出來的部份反摺到玻璃背面，用手抹平表面水份，並用紙巾吸乾。次日即可得到已經乾燥好的膠片。 待膠片完全乾燥後，以美工刀或剪刀去除多餘的玻璃紙，再加以護貝，則可永久保存之。免疫染色的轉印紙，也可以護貝保存。

乾燥之膠片示例 Marker S P W2 W5 E1 E2 E3 E4 E5 Esterase

本單元結束